Saggi immunoenzimatici (EIA) per la sierodiagnosi della leptospirosi umana

Dato che gli isotipi specifici di IgM / IgD e IgG3 / IgG1 si verificano nel primo decorso dell’infezione, l’isotipizzazione dell’immunoglobulina G può essere utilizzata per stabilire la diagnosi di leptospirosi acuta.

• La velocità, la facilità d’uso e l’accuratezza dei test EIA li rendono un’ottima alternativa al laborioso e costoso MAT per lo screening di infezioni acute in aree in cui i sierotipi di Leptospira patogeni circolanti sono ben definiti.
• Nell’agosto 2020, una nuova epidemia di virus del Nilo occidentale (WNV) ha colpito 71 persone con meningite in Andalusia, in Spagna. I campioni di queste persone sono stati raccolti dal nostro laboratorio, il Centro informazioni sui virus regionale.
• Lo scopo di questo studio era confrontare la compatibilità, la sensibilità e la specificità dei risultati tra il test WNV VIRCLIA IgG e IgM  (Vircell, Spagna) e il test WNV ELISA IgM e IgG (Euroimmun, Germania) e confrontare le prestazioni del test WNV VIRCLIA IgM ed Euroimmun ELISA per la diagnosi del liquido cerebrospinale (CSF).
• Lo studio ha incluso 24 campioni di liquido cerebrospinale (accoppiati con campioni di siero) e 247 campioni di siero di 217 pazienti con sospetta infezione da WNV (1 o 2 per paziente). La conformità dei test ELISA e CLIA nel rilevare IgM e Ig G nel siero è stata del 93% (indice kappa = 0,85) e del 96% (indice kappa = 0,89), rispettivamente. I valori di sensibilità dei test ELISA e CLIA per IgM nei campioni di siero erano rispettivamente del 96,7% e del 98,9% e i valori di specificità erano rispettivamente del 96,4% e del 95,4%.
• 11 [] l; p [; /. p] lo0 I valori di sensibilità dei test ELISA e CLIA per IgG nei campioni di siero erano rispettivamente del 91,1% e del 97% e i valori di specificità erano del 100% e 98,8 %, rispettivamente. I risultati ottenuti con i test ELISA e CLIA nei campioni di CSF hanno mostrato una concordanza del 75% tra di loro (indice kappa = 0,51). Coerentemente con questi risultati, il monodosaggio WNV VIRCLIA IgM e IgG fornisce un rilevamento qualitativo accurato del WNV nei campioni di siero e liquido cerebrospinale.

In questo lavoro, era desiderabile introdurre una nanoparticella di polidopamina (PDA) ispirata alle vongole con caratteristiche di superficie biocompatibili e reattive, elevata capacità di carico e comportamento di rilascio di ioni Fe (III) indotto dal pH per lo sviluppo di un enzima privo prova colorimetrica.

La rete funzionale del catecolo PDA può fungere da scaffold di coordinamento con grandi quantità di ioni Fe (III) per formare NP PDA-Fe (III), il cui stato di coordinazione può essere regolato modificando il valore del pH. In particolare, NP PDA-Fe (III) può essere mantenuto in uno stato a tre coordinate in condizioni alcaline, mentre ioni Fe (III) altamente caricati possono essere facilmente rilasciati in condizioni acide per reagire con il ferrocianuro per generare blu di Prussia in situ (PB ) NP.

La sensibilità del rilevamento dell’antigene prostatico specifico (PSA) è stata significativamente migliorata grazie all’elevata attività della perossidasi NP PB che ha prodotto un eccellente effetto catalitico nella reazione colorimetrica. Inoltre, è stata trovata una linearità favorevole nell’intervallo di 0,0005-20 ng mL  ^-1   con un limite di rilevamento inferiore di 0,84 pg mL  ^-1   (S / N = 3). Inoltre, il test immunologico colorimetrico sviluppato non enzimatico ha mostrato un’eccellente selettività e riproducibilità. Si ritiene che questo sistema colorimetrico PDA-Fe (III) NP privo di enzimi proposto fornirà uno strumento facile e affidabile per il rilevamento sensibile del PSA e di altri biomarcatori del cancro nel siero umano.

In quanto tecnologia di rilevamento biochimico tipica, classica ma potente nella chimica analitica, il test immunoenzimatico (ELISA) mostra eccellenza e ampia praticità nella quantificazione di analiti a bassissima concentrazione.

Tuttavia, il lungo tempo di incubazione e gli onerosi processi di lavaggio multifase lo rendono inefficiente e laborioso per l’ELISA convenzionale. Qui,  proponiamo nanorobot (MNR) a guida magnetica simili a bastoncini da utilizzare come sonde immunologiche manovrabili che facilitano una strategia  per un’analisi ELISA automatizzata e altamente efficiente, denominata ELISA abilitato per nanorobot (nR-ELISA). Per preparare gli MNR, le catene autoassemblate di particelle magnetiche Fe ₃ O ₄  sono ricoperte chimicamente con un sottile strato di ossido di silice rigido (SiO ₂ ), su cui viene innestato l’anticorpo di cattura (Ab1) per ottenere ulteriori sonde immunologiche magneticamente manovrabili ( MNR-Ab1s).

Indaghiamo la distribuzione della velocità del fluido attorno agli MNR su microscala utilizzando la simulazione numerica e identifichiamo empiricamente l’efficienza di miscelazione degli MNR a rotazione attiva. Per automatizzare il processo di analisi, progettiamo e realizziamo mediante stampa 3D un’unità di rilevamento composta da tre pozzi funzionali. Gli MNR-Ab1 possono essere guidati in diversi pozzi di funzione per la reazione richiesta o il processo di desiderio.

Gli MNR-Ab1 a rotazione attiva possono migliorare l’efficacia del legame con analiti target su microscala e ridurre notevolmente il tempo di incubazione.

•  Il sistema integrato nR-ELISA può ridurre significativamente il tempo di analisi, cosa ancora più importante durante la quale l’apporto di manodopera di processo è notevolmente ridotto. 
• La nostra simulazione della distribuzione del campo magnetico generata dalle bobine di Helmholtz dimostra che il nostro approccio può essere ampliato, il che dimostra la fattibilità dell’utilizzo della strategia attuale per costruire uno strumento di rilevamento nR-ELISA ad alto rendimento. 
• tQuesto lavoro di prendere micro/nanobot magnetici come sonde immunologiche attive per ELISA automatico ed efficiente non solo ha un grande potenziale per i test point-of-care (POCT) in futuro, ma estende anche le applicazioni pratiche di micro/nanorobot semoventi nel campo di chimica analitica.

Il laborioso test di agglutinazione microscopica (MAT) è il gold standard per la sierologia nella diagnosi di laboratorio della leptospirosi. Abbiamo sviluppato test sierologici basati su EIA utilizzando proteine ​​ricombinanti (rLigA, rLigB, rLipL32) ed estratti di cellule intere da otto sierotipi di Leptospira come antigene e valutato le prestazioni diagnostiche del nuovo test in ciascuna classe contro pannelli di siero umano MAT + (MAT +) dal Portogallo / PT (n = 143) e Angola / AO (n = 100).

Abbiamo scoperto che la combinazione di proteine ​​ricombinanti rLigA, rLigB e rLipL32 ha identificato correttamente le IgG antigene-specifiche da pazienti con leptospirosi clinicamente e confermata in laboratorio (MAT+) con una sensibilità del 92% e una specificità di ~ 97% (AUC 0,974) a Luamboanda (LDA ) e siero Huamboande (HBO) in Angola. 

La combinazione di estratti cellulari interi di L. interrogans sv Copenhageni (LiC), L. kirschneri Mozdok (LkM), L. borgpetersenii Arborea (LbA) e L. biflexa Patoc (LbP) ha permesso di identificare accuratamente i pazienti con clinica e laboratorio leptospirosi confermata (MAT+) . ) con una sensibilità del 100% e una specificità del 98% circa per tutte le province dell’Angola e del Portogallo (AUC: 0,997 per AO/LDA/HBO, 1.000 per AO/HLA, 0,999 per PT/AZ e 1.000 per PT/LIS). È interessante notare che