Luglio 2, 2022

Inibizione della metilazione del DNA da parte di agenti cancerogeni chimici in vitro

Il ruolo dell’eta DNA polimerasi nello spettro delle mutazioni UV nelle cellule umane.Nell’uomo, l’inattivazione del gene della DNA polimerasi eta (pol eta) provoca sensibilità alla luce solare e provoca la variante incline al cancro xeroderma pigmentoso (XP-V). Le cellule degli individui XP-V hanno una ridotta capacità di replicare il DNA danneggiato dalle radiazioni UV e mostrano ipermutabilità dopo l’esposizione alle radiazioni UV.

  • I test biochimici hanno dimostrato la capacità della trama di bypassare   i dimeri cis-syn-ciclobutano della timina  ,   il danno al DNA più comune generato dai raggi UV. Nella maggior parte dei casi, questa soluzione è impeccabile. Per determinare l’effettiva domanda di campo in vivo, le cellule XP-V (XP30RO) sono state integrate con il gene della poleta di tipo selvaggio.
  • Abbiamo utilizzato due   cloni corretti sul campo  per studiare la caratterizzazione in vivo delle mutazioni prodotte dalle DNA polimerasi durante la sintesi del DNA di vettori navetta irradiati con UV trasfettati in cellule ospiti umane che erano o non erano state precedentemente esposte a radiazioni UV.
  • Il rifornimento funzionale delle cellule XP-V da parte dei grafici ha ridotto la frequenza di mutazione nelle coppie di basi CG e TA e ripristinato la mutagenesi UV a livelli normali. L’irradiazione UV delle cellule ospiti prima della trasfezione ha notevolmente aumentato la frequenza di mutazione nei vettori intatti e, inoltre, specialmente nelle cellule XP30RO carenti di pulci nei siti 5′-TT dei plasmidi irradiati con UV.
  • Questi risultati dimostrano chiaramente il ruolo protettivo della trama contro i cambiamenti indotti dalla radiazione UV e l’attivazione di processi mutageni indipendenti dalla trama da parte degli UV.

Clonazione molecolare del gene di riparazione umano mediante escissione del nucleotide ERCC4.

  1. ERCC4 è stato precedentemente identificato negli ibridi di cellule somatiche come un gene umano che corregge una carenza di riparazione dell’escissione nucleotidica nelle cellule di criceto mutanti. La strategia di clonazione ERCC4  prevedeva la trasfettazione della linea cellulare di criceto carente di riparazione UV41 con una libreria cosmidica umana sCos-1 derivata dal cromosoma 16.
  2. È stata osservata una maggiore resistenza ai raggi UV con un trasformante dalla libreria dei cosmidi e due trasformanti secondari UV41. I cloni cosmidi che  ospitano un gene ERCC4 funzionale sono stati isolati dalla libreria trasformante secondaria mediante selezione in Escherichia coli per esprimere il gene di resistenza alla neomicina fuso che era presente nel vettore sCos-1.
  3. Cosmidi mappati su 16p13.13-p13.2, una posizione assegnata a ERCC4, utilizzando ibridi di cellule somatiche. Dopo la trasfezione in UV41, i sei   cloni cosmidi  hanno fornito correzioni parziali che vanno dal 30% al 64%, sebbene tutti sembrassero contenere l’intero gene  . La capacità di asportare in vitro   i dimeri  di timina    da un plasmide mediante estratti cellulari trasformanti è qualitativamente correlata con l’aumentata resistenza alle radiazioni UV.

Effetto delle radiazioni ultraviolette (UV) A, UVB o ionizzanti sul ciclo cellulare delle cellule di melanoma umano.

  • Uno dei componenti importanti di una risposta cellulare alle radiazioni è l’attivazione dei checkpoint del ciclo cellulare. È noto che sia la radiazione ultravioletta (UV) che quella ionizzante (IR) possono attivare checkpoint nel passaggio dalla fase G (1) alla fase S, da G (2) alla mitosi e durante la replicazione del DNA.
  • Valutazione dell’impatto dell’irradiazione con diverse lunghezze d’onda sulle variazioni del ciclo cellulare.
  • Le cellule di melanoma IPC-298 carenti di p53 sono state irradiate con 10 J cm (-2) UVA, 40 mJ cm (-2) UVB o 7,5 Gy IR. Gli effetti del ciclo cellulare sono stati quindi determinati mediante citometria a flusso di DNA/5-bromodeossiuridina a due parametri.
  • Le cellule IPC-298 irradiate in G (1) con UVA non sono state arrestate alla transizione G (1) / S, ma alla transizione G (2) / M. Nonostante la carenza di p53, le cellule hanno mostrato l’arresto di G (1) dopo l’esposizione ai raggi UVB. Inoltre, IR non ha influenzato la fase G (1) o S, ma ha causato un arresto della fase G (2). Quindi, l’effetto degli UVA, ma non degli UVB, sul ciclo cellulare nelle cellule di melanoma carenti di p53 è paragonabile a quello dell’IR.
  • UVA e IR inducono rotture del filamento e danni al DNA mediati dai radicali e UVB essenzialmente induce   dimeri  di timina    che portano a rotture del filamento associate alla riparazione dell’escissione. Diversi effetti del ciclo cellulare possono essere una conseguenza di diversi tipi di danno al DNA. I risultati hanno mostrato che le cellule carenti di p53 irradiate da UVB vengono mantenute in G (1). L’irradiazione con la componente solare della radiazione UVB può quindi ritardare vantaggiosamente la crescita del tumore nella pelle umana che porta   cloni cellulari  con la mutazione p53.

Fotochimica catalizzatrice dei desossiribozimi: fotoriparazione   di dimeri  di timina   dipendenti e indipendenti dal cofattore.

  • Le strategie sperimentali di selezione in vitro progettate per testare la validità dell ‘”ipotesi del mondo dell’RNA” hanno mostrato una gamma catalitica molto più ampia per l’RNA (e gli acidi nucleici in generale) rispetto ai ribozimi naturali.
  • Volevamo indagare se le reazioni fotochimiche potessero essere catalizzate dagli enzimi dell’acido nucleico. Sono stati effettuati esperimenti di selezione in vitro per ottenere deossiribozimi “fotoliasi” in grado di fotorevertire   i dimeri  di ciclobutano timina  in presenza del cofattore serotonina.
  • Durante la selezione in vitro dalla   timina  –  un dimero   contenente una libreria di DNA casuale irradiata con una luce > 300 nm, sono comparsi due pool di molecole di nuclei catalitici – uno che richiedeva serotonina per l’attività e l’altro, sorprendentemente, no. La caratterizzazione  dei cloni indipendenti dalla serotonina ha mostrato che la lunghezza d’onda ottimale per la loro attività di riparazione (circa 1400 volte) è di circa 300 nm, in particolare spostata verso il rosso dal massimo assorbimento del solo DNA.

Una vasta gamma di agenti cancerogeni chimici finali ha inibito il trasferimento di gruppi metilici dalla S-adenosilmetionina al DNA emimetilato in una reazione catalizzata dalla metiltransferasi della milza di topo.

  1. La formazione di siti labili alcalini nel DNA ha ridotto la sua capacità di accettare gruppi metilici in vitro, ma la reazione di metilazione era molto meno sensibile ai  dimeri  di timina    o alle rotture del doppio filamento  . Gli agenti cancerogeni hanno indotto la formazione di danno al DNA labile alcalino, ma il grado osservato di inibizione della metiltransferasi era superiore a quello previsto per questo danno da solo.
  2. Alcuni agenti cancerogeni sono stati anche in grado di modificare e inattivare direttamente l’enzima metiltransferasi. Il trattamento con benzo(a)pirene su cellule BALB / 3T3 A31 vive dal   clone   1-13, ma non con cellule C3H / 10T1 / 2   clone   8, ha comportato una diminuzione del 12% del contenuto totale di 5-metilcitosina nel DNA cellulare .

Anti-HIV Type 1 RT Clone 39/4.12.2 (100 µg)

0801007 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type I p24 Clone 46/3.24.4 (100 µg)

0801018 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HIV Type 1 p17 Clone 32/1.24.89 (100 µg)

0801077 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 32/5.17.76 (100 µg)

0801078 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/5.1.23 (100 µg)

0801079 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/5.4A (100 µg)

0801080 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HIV Type 1 p24 Clone 39/6.14 (100 µg)

0801081 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type I p19 Clone 45/6.11.1.3 (100 µg)

0801082 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 67/5.5.13.1 (100 µg)

0801084 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 68/4.11.21 (100 µg)

0801085 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type II gp46 Clone 73/4.9.8 (100 µg)

0801086 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type II p24 Clone 75/4.21.11 (100 µg)

0801087 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type II p19 Clone 78/6.18.07 (100 µg)

0801093 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Anti-HTLV Type I gp46 Clone 65/6C2.2.34 (100 µg)

0802004 Zeptometrix 100 µg 284 EUR

Thymine

HY-W010450 MedChemExpress 500mg 108 EUR

Thymine

abx082195-5g Abbexa 5 g 203 EUR

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abx082345-5g Abbexa 5 g 217 EUR

Thymine

TB0943 Bio Basic 100g 84.8 EUR

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GE5340-25G Glentham Life Sciences 25 g 62 EUR

Thymine

GE5340-5G Glentham Life Sciences 5 g 44 EUR

Thymine

TBW00812 ChemNorm 100mg Ask for price

CORNING® RLAMININ-521 (HUMAN), 100 µG

354221 CORNING 1/pk 86 EUR

Bcl-2 Antibody (Clone Bcl-2/100)

3195-100 Biovision 359 EUR

LIMITED QTY-Dinucleotide Standards Thymine Glycol Cytidine Dimer d (TgpC) (50µg)

0801216 Zeptometrix 50µg 118.64 EUR

LIMITED QTY-Dinucleotide Standards Formamido Guanine Dimer d (PfpG) (50 µg)

0801210 Zeptometrix 50 µg 118.64 EUR

LIMITED QTY-Dinucleotide Standards Formamido Cytidine Dimer d (PfpC) (50 µg)

0801211 Zeptometrix 50 µg 118.64 EUR

LIMITED QTY-Dinucleotide Standards Formamido Adenine Dimer d (PfpA) (50 µg)

0801213 Zeptometrix 50 µg 118.64 EUR

D-Dimer, Human Plasma

P1434-100 Biovision 207 EUR

LIMITED QTY-rhIL-2 Recombinant Human Interleukin-2 (100 µg)

0802001 Zeptometrix 100 µg 362 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Plasma, 2 vials)

M1041-2 Biovision 711 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Plasma, 4 vials)

M1041-4 Biovision 1137 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Plasma, 6 vials)

M1041-6 Biovision 1572 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Serum, 2 vials)

M1043-2 Biovision 713 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Serum, 4 vials)

M1043-4 Biovision 1132 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Serum, 6 vials)

M1043-6 Biovision 1572 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Urine, 2 vials)

M1045-2 Biovision 707 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Urine, 4 vials)

M1045-4 Biovision 1137 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Urine, 6 vials)

M1045-6 Biovision 1572 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Saliva, 2 vials)

M1047-2 Biovision 729 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Saliva, 4 vials)

M1047-4 Biovision 1137 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, Human Saliva, 6 vials)

M1047-6 Biovision 1621 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, U87 MG, 2 vials)

M1055-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, U87 MG, 4 vials)

M1055-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, U87 MG, 6 vials)

M1055-6 Biovision 1616 EUR

AIM-100

A3148-100 ApexBio 100 mg 1859 EUR

LB-100

B4846-100 ApexBio 100 mg 860 EUR

Monoclonal Bcl-2 Antibody (Clone Bcl-2/100), Clone: Bcl-2/100

APG02224G Leading Biology 0.1mg 484 EUR

Anti-D-Dimer Detection Antibody

A2090-100 Biovision 100 µg 338 EUR

Anti-D-Dimer Detection Antibody

A2091-100 Biovision 100 µg 338 EUR

S-100; Clone 4C4.9 (Concentrate)

A00087-C ScyTek Laboratories 1 ml 453 EUR

S-100; Clone 4C4.9 (Concentrate)

A00087-C.1 ScyTek Laboratories 0.1 ml 138 EUR

Amphotericin B (Fungizone) Sol, 250 µg/mL

CCM1120-100 Bio Basic 100 mL 110.23 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, COLO1 cell line, 2 vials)

M1049-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, COLO1 cell line, 4 vials)

M1049-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, COLO1 cell line, 6 vials)

M1049-6 Biovision 1616 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, MM1 cell line, 2 vials)

M1051-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, MM1 cell line, 4 vials)

M1051-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, MM1 cell line, 6 vials)

M1051-6 Biovision 1616 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, BLCL21 cell line, 2 vials)

M1053-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, BLCL21 cell line, 4 vials)

M1053-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, BLCL21 cell line, 6 vials)

M1053-6 Biovision 1572 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, HCT116 cell line, 2 vials)

M1059-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, HCT116 cell line, 4 vials)

M1059-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, HCT116 cell line, 6 vials)

M1059-6 Biovision 1616 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, PC3 cell line, 2 vials)

M1061-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, PC3 cell line, 4 vials)

M1061-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, PC3 cell line, 6 vials)

M1061-6 Biovision 1616 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, DAUD1 cell line, 2 vials)

M1065-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, DAUD1 cell line, 4 vials)

M1065-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, DAUD1 cell line, 6 vials)

M1065-6 Biovision 1616 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, A549 cell line, 2 vials)

M1067-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, A549 cell line, 4 vials)

M1067-4 Biovision 1142 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, A549 cell line, 6 vials)

M1067-6 Biovision 1616 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, B16F10 cell line, 2 vials)

M1071-2 Biovision 718 EUR

ExoStd? Lyophilized Exosome Standard (100 µg, B16F10 cell line, 4 vials)

M1071-4 Biovision 1142 EUR

MTBK_20640-100

AR02-P0011-100 Abfrontier 100ug 1133 EUR

hCRP FRET 100

CH1008-100 Mediomics 1 Kit 212 EUR

hCRP TRF 100

CHTR1008-100 Mediomics 1 Kit 239 EUR

hAlbumin FRET 100

AH1005-100 Mediomics 1 Kit 212 EUR

hAlbumin TRF 100

AHTR1005-100 Mediomics 1 Kit 239 EUR

hIgG TRF 100

HITR1011-100 Mediomics 1 Kit 239 EUR

hInsulin FRET 100

IH1010-100 Mediomics 1 Kit 212 EUR

hInsulin TRF 100

IHTR1010-100 Mediomics 1 Kit 239 EUR

S-100 Antibody

3958-100 Biovision 316 EUR

Etoposide (100 mM)

1043-100 Biovision 153 EUR

rIgG FRET 100

RI1015-100 Mediomics 1 Kit 212 EUR

Pertanto, gli agenti cancerogeni possono causare alterazioni ereditarie nei modelli di 5-metilcitosina in alcuni tipi di cellule mediante una varietà di meccanismi tra cui la formazione di addotti, l’induzione di siti apurina e le rotture di un singolo filamento e l’inattivazione diretta della DNA metiltransferasi.

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