Nei bifidobatteri, la fosfochetolasi (PKT) svolge un ruolo chiave nel percorso centrale della fermentazione dell’esoso noto come “perdita di bifidi”.
La struttura tridimensionale di PKT da Bifidobacterium longum con tiamina difosfato coenzima (ThDpp) è stata determinata con una risoluzione di 2,1 Å mediante analisi di singole particelle crio-EM con 196.147 particelle per costruire un modello strutturale di ottamero PKT legato dalla simmetria D4. Sebbene la struttura crio-EM del PKT fosse quasi identica alla struttura cristallina dei raggi X precedentemente determinata con una risoluzione di 2,2 Å, nella struttura crio-EM sono state osservate alcune caratteristiche strutturali interessanti.
Poiché questa struttura è stata risolta a una risoluzione relativamente alta, è stato osservato che diversi residui di amminoacidi adottano conformazioni multiple. Tra questi, Q546-D547-H548-N549 (anello QN) mostrano il più grande cambiamento strutturale che sembra essere correlato alla funzione enzimatica della PKT. L’anello QN si trova all’ingresso della tasca di rilegatura del substrato. Il conformatore ad anello QN più piccolo è simile a quello dell’anello QN nella struttura cristallina. Il conformatore maggiore è più lontano da ThDpp del conformero minore.
È interessante notare che il conformatore principale nella struttura PKT cryo-EM assomiglia alla struttura corrispondente dell’ansa legata al substrato di Escherichia coli transketolasi.
- Cioè, i conformeri minori e principali possono corrispondere rispettivamente agli stati “chiuso” e “aperto” per l’accesso al substrato. Inoltre, molte molecole d’acqua sono state osservate nella struttura crio-EM del PKT grazie all’analisi ad alta risoluzione.
- Le caratteristiche strutturali delle molecole d’acqua nella struttura crio-EM sono discusse e confrontate con le molecole d’acqua osservate nella struttura cristallina.
- Il complesso dei pori nucleari (NPC) trasporta la carica attraverso l’involucro nucleare. Qui presentiamo la struttura monoparticella crio-EM della subunità ad anello nucleare (NR) dell’NPC Xenopus laevis con una risoluzione media di 5,6 Å. La subunità NR contiene due complessi Y a 10 membri, ciascuno con nucleoporina ELYS strettamente associato a Nup160 e Nup37 a braccio lungo.
- A differenza del citoplasmatico (CR) o dell’anello interno (IR), la subunità NR contiene solo una molecola Nup205 e Nup93. Nup205 lega entrambi i bracci dei complessi Y e interagisce con il nucleo del complesso Y interno dalla subunità adiacente. Nup93 unisce gli steli dei complessi Y interno ed esterno nella stessa subunità NR e posiziona la sua elica allungata al terminale N nella scanalatura assiale di Nup205 da una subunità adiacente.
- Insieme ad altre informazioni strutturali, abbiamo generato un modello atomico complesso dello scaffold ad anello centrale che include NR, IR e CR. L’IR è collegato ai due anelli esterni principalmente tramite Nup155. Questo modello facilita una comprensione funzionale degli NPC vertebrati.
Abbiamo recentemente dimostrato come le goccioline lipidiche possono servire come dati in situ per la correlazione di set di dati di criofluorescenza (crio-FM) e microscopia elettronica crio-focalizzata (crio-FIB-SEM) di cellule di mammifero cresciute su griglie. Qui descriviamo passo dopo passo il protocollo per la correlazione crio-FM e crio-FIB-SEM, a partire dalla preparazione del campione della linea cellulare C2C12, seguita dall’imaging con crio-FM e crio-FIB-SEM. Infine, descriviamo in dettaglio come eseguire una correlazione 3D con precisione submicronica. Per i dettagli sull’uso e le prestazioni di questo profilo, vedere Scher et al. (2021).
Il recettore di smistamento ripetuto di tipo A (SORLA) è un importante recettore che regola la normale funzione cellulare attraverso lo smistamento delle proteine.
Qui, abbiamo determinato le strutture SORLA a tutta lunghezza e identificato due diverse conformazioni apo-SORLA utilizzando la microscopia elettronica criogenica a singola molecola. Contrariamente alle proteine omologhe, sia la forma monomerica che quella dimerica di SORLA esistevano in soluzione neutra.
- Solo tre legami idrogeno vicino all’interfaccia del dimero suggerivano la partecipazione alla dimerizzazione. L’orientamento del residuo R490 era il punto chiave per il legame del ligando. Questi risultati suggeriscono un meccanismo unico di dimerizzazione SORLA nel trasporto delle proteine.
- La microscopia crioelettronica (crio-EM) si è rivelata uno strumento senza precedenti per il riconoscimento delle strutture proteiche a risoluzione atomica. Le intuizioni strutturali di campioni biologici non disponibili nella cristallografia a raggi X e nell’NMR convenzionali possono essere studiate dalla crio-EM perché le misurazioni vengono effettuate in condizioni quasi native prive di cristalli e i grandi complessi proteici con eterogeneità conformazionale e dei componenti sono facilmente risolvibili.
- L’RNA rimane poco studiato nella crio-EM, nonostante il suo ruolo essenziale in vari processi biologici. Questa recensione mette in evidenza le sfide attuali e i recenti progressi nell’uso dell’analisi crio-EM a particella singola per definire strutture di RNA prive di proteine, consentendo una migliore preparazione del campione e l’integrazione di molti metodi strutturali e biochimici.
- La p97 ATPasi conservatrice (Cdc48 nel lievito) e gli adattatori mediano vari processi cellulari scomponendo le proteine poliubiquitinate ed estraendole da assemblaggi e membrane macromolecolari per la loro disaggregazione e degradazione.
- I domini tandem ATPasi (D1 e D2) dell’esamero p97 / Cdc48 formano anelli impilati. p97 / Cdc48 può dispiegare i substrati facendoli passare attraverso il poro centrale.Gli anelli dei pori critici per lo spiegamento del substrato, tuttavia, non sono ben ordinati nella conformazione p97 / Cdc48 senza substrato.
Dry DMSO, 5ML |
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X022-5ML | Arbor Assays | 5ML | 122 EUR |
EvaGreen, 2000X in DMSO |
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31019 | Biotium | 50uL | 245 EUR |
DMAO, 2mM in DMSO |
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40012 | Biotium | 1ML | 296 EUR |
250 ML DMSO (DIMETHYL SULFOXIDE) |
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25-950-CQC | CORNING | 250 mL/pk | 94 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
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40061 | Biotium | 250uL | 362 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
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40061-1 | Biotium | 1mL | 561 EUR |
RedDot 2, 200X in DMSO |
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40061-T | Biotium | 25uL | 131 EUR |
Thiazole Orange, 10mM in DMSO |
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40077 | Biotium | 1mL | 145 EUR |
NucSpot 470, 1000X in DMSO |
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40083 | Biotium | 200uL | 372 EUR |
NucSpot 470, 1000X in DMSO |
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40083-T | Biotium | 20uL | 106 EUR |
Thiazole Red, 1mM in DMSO |
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40087 | Biotium | 1mL | 320 EUR |
Oxazole Yellow, 1mM in DMSO |
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40089 | Biotium | 1mL | 336 EUR |
LysoView 540, 1000X in DMSO |
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70061 | Biotium | 50uL | 205 EUR |
LysoView 540, 1000X in DMSO |
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70061-T | Biotium | 10uL | 94 EUR |
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO |
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70066 | Biotium | 50uL | 201 EUR |
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO |
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70067 | Biotium | 50uL | 201 EUR |
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO |
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70068 | Biotium | 20X50UG | 255 EUR |
DMSO, labeling grade, 1 mL |
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15050 | Lumiprobe | 1 mL | 37 EUR |
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile) |
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C084-10x1ML | TOKU-E | 10x1 mL | 194 EUR |
Cycloheximide Solution (10% in DMSO Sterile) |
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C084-1ML | TOKU-E | 1 mL | 54 EUR |
Ethidium homodimer I, 2mM DMSO solution |
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40014 | Biotium | 0.5ML | 257 EUR |
Ethidium homodimer III, 1mM in DMSO |
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40051 | Biotium | 200uL | 312 EUR |
Thiazole Red Homodimer, 1mM in DMSO |
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40080 | Biotium | 200uL | 355 EUR |
NucSpot Live 488, 1000X in DMSO |
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40081 | Biotium | 50uL | 355 EUR |
NucSpot Live 488, 1000X in DMSO |
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40081-T | Biotium | 10uL | 116 EUR |
NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO |
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40085 | Biotium | 0.5mL | 563 EUR |
NucSpot Far-Red, 1000X in DMSO |
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40085-T | Biotium | 50uL | 131 EUR |
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO |
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40086-0.5mL | Biotium | 0.5mL | 188 EUR |
Thiazole Green, 10, 000X in DMSO |
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40086-1mL | Biotium | 1mL | 287 EUR |
TMRE, 2 mM solution in DMSO |
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70005 | Biotium | 0.5ML | 149 EUR |
Calcein AM, 4mm in anhydrous DMSO |
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80011-1 | Biotium | 100uL | 226 EUR |
6-TAMRA, SE in DMSO:100uL |
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90097 | Biotium | 100uL | 307 EUR |
6-Rox, SE in DMSO:(100uL) |
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90098 | Biotium | 100uL | 307 EUR |
Thiazole orange *10 mM in DMSO* |
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17519 | AAT Bioquest | 10 mL | 115 EUR |
EGTA AM *10 mM DMSO solution* |
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21006 | AAT Bioquest | 1 mL | 176 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail I (100X in DMSO) |
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HY-K0021 | MedChemExpress | 1 mL × 10 | 412 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail III (100X in DMSO) |
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HY-K0023 | MedChemExpress | 1 mL × 50 | 2162 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
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HY-K0030 | MedChemExpress | 1 mL × 10 | 279 EUR |
Thiazole Orange Homodimer, 1 mM in DMSO |
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40079 | Biotium | 200uL | 439 EUR |
TO iodide (515/531), 1mM in DMSO |
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40088 | Biotium | 1mL | 303 EUR |
Pluronic f-127 20% solution in DMSO |
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59004 | Biotium | 1ML | 66 EUR |
LysoViewâ„¢ 405, 1000X in DMSO, Trial Size |
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70066-T | Biotium | 10uL | 93 EUR |
LysoViewâ„¢ 488, 1000X in DMSO, Trial Size |
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70067-T | Biotium | 10uL | 93 EUR |
MitoViewâ„¢ 720, 1000X in DMSO, Trial Size |
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70068-T | Biotium | 50UG | 104 EUR |
Calcein AM, 1mg/ml in anhydrous DMSO |
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80011-2 | Biotium | 1ML | 231 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO) |
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K1012-1 | ApexBio | 1 ml | 102 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 (100X in DMSO) |
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K1012-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1592 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO) |
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K1014-1 | ApexBio | 1 ml | 113 EUR |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (100X in DMSO) |
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K1014-50 | ApexBio | 50x1 ml | 2184 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
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K1017-1 | ApexBio | 1 ml | 87 EUR |
Deacetylase Inhibitor Cocktail (100× in 70% DMSO) |
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K1017-50 | ApexBio | 50x1 ml | 792 EUR |
EZBlock? Protease Inhibitor Cocktail VIII, DMSO-Free |
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K395-1 | Biovision | 126 EUR | |
EZBlock? Protease Inhibitor Cocktail VIII, DMSO-Free |
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K395-set | Biovision | 392 EUR | |
Cyanine3 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
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11030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 108 EUR |
Cyanine3.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
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12030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
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13030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine5.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
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14030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine7 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
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15030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine7.5 azide, 100 uL, 10 mM/DMSO |
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16030 | Lumiprobe | 100 µl | 108 EUR |
Cyanine5.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
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34030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine7 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
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35030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine7.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
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36030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine3 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
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41030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 316 EUR |
Cyanine3.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
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42030 | Lumiprobe | 1 ml | 316 EUR |
Cyanine5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
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43030 | Lumiprobe | 1 ml | 316 EUR |
Cyanine5.5 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
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44030 | Lumiprobe | 1 ml | 316 EUR |
Cyanine7 azide, 1 mL, 10 mM/DMSO |
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45030 | Lumiprobe | 1 mL | 316 EUR |
Cyanine3 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
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31030 | Lumiprobe | 10 mM/DMSO | 182 EUR |
Cyanine3.5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
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32030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Cyanine5 azide, 500 uL, 10 mM/DMSO |
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33030 | Lumiprobe | 500 µl | 182 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
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HY-K0010 | MedChemExpress | 1 mL × 100 | 1772 EUR |
NucView 488 Caspase-3 Substrate, 1mM in DMSO |
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10402 | Biotium | 100uL | 396 EUR |
NucView 488 Caspase-3 Substrate, 1mM in DMSO |
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10402-T | Biotium | 10uL | 120 EUR |
Fluo-3, AM ester, 1mm in anhydrous DMSO |
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50015 | Biotium | 1ML | 259 EUR |
Fura-2, AM ester, 1mm in anhydrous DMSO |
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50029 | Biotium | 1ML | 222 EUR |
BCECF, AM ester 1mg/ml in dry DMSO |
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51009 | Biotium | 1ML | 155 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO) |
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K1007-1 | ApexBio | 1 ml | 81 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO) |
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K1007-20 | ApexBio | 20x1 ml | 514 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail(EDTA-Free,100X in DMSO) |
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K1007-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1094 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO) |
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K1008-1 | ApexBio | 1 ml | 81 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO) |
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K1008-20 | ApexBio | 20x1 ml | 514 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 200X in DMSO) |
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K1008-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1094 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
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K1009-1 | ApexBio | 1 ml | 90 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
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K1009-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1210 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
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K1010-1 | ApexBio | 1 ml | 90 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
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K1010-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1210 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
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K1011-1 | ApexBio | 1 ml | 90 EUR |
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-Free, 100X in DMSO) |
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K1011-50 | ApexBio | 50x1 ml | 1210 EUR |
Non è chiaro come p97 / Cdc48 organizzi i suoi loop dei pori in termini di coinvolgimento del substrato. Qui mostriamo che p97 / Cdc48 possono formare doppi esameri (DH) collegati a D2. Le strutture Cryo-EM p97 DH mostrano una conformazione competente per ATPasi con anelli di pori ordinati.L’estensione C-terminale (CTE) si unisce all’adiacente D2 in ciascun esamero e allarga il poro centrale dell’anello D2. Le mutazioni di Cdc48 CTE aboliscono lo sviluppo del substrato. Proponiamo che p97 / Cdc48 DH catturi uno stato avanzato pronto per il coinvolgimento del substrato.