by Verso la standardizzazione dei saggi immunologici dell’insulina .La misurazione dell’insulina circolante può migliorare la classificazione e il trattamento del diabete e aiutare a curare le persone con insulino-resistenza .
- Un gruppo di lavoro convocato dall’American Diabetes Association ha valutato i risultati di un pannello di 39 sieri di un singolo donatore, misurati con 10 metodi di insulina commerciali di 9 produttori, rispetto a una procedura di misurazione della cromatografia liquida isotopica / spettrometria di massa tandem (IDMS) calibrata utilizzando ricombinante purificato insulina . Abbiamo utilizzato materiale di riferimento candidato dall’originale (sostanza pura), pool di siero e sieri di un singolo donatore per valutare gli approcci per ottenere una migliore corrispondenza dei risultati tra le procedure di misurazione di routine e di riferimento.
- Quattro dei 10 metodi ottenuti >> o = 95% dei risultati sierici individuali entro il 32% delle concentrazioni IDMS. Tuttavia, la distorsione rispetto all’IDMS era superiore al 15,5% per 7 metodi su 10 nel 36% -100% dei singoli campioni. La preparazione di insulina ricombinante purificata utilizzata come calibratore comune non ha migliorato l’armonizzazione dei risultati tra i metodi di routine, ma non è stata utilizzata come raccomandato da tutti i partecipanti. La calibrazione con pool di siero ha ottenuto un errore sistematico <15,5% per quasi tutti i risultati nell’intervallo di concentrazione coperto dai pool (> 60 pmol/L). La calibrazione utilizzando un pannello di singoli sieri si è rivelata più efficace nel migliorare l’armonizzazione dei risultati sull’intero intervallo di misurazione.
- La compatibilità tra i metodi può essere migliorata stabilendo la tracciabilità della procedura IDMS utilizzando il pannello dei sieri nativi. I sieri raccolti possono essere utili come materiali per il controllo della verità. L’ idoneità del materiale di riferimento primario per l’ insulina pura [materiale di riferimento dell’insulina candidato ( cRMI)] richiede una spiegazione dei protocolli utilizzati dai produttori.
Saggio immunoenzimatico ad alta sensibilità per l’immunoreattività alla proinsulina utilizzando due anticorpi monoclonali.
- È stato sviluppato un ELISA sandwich a due siti altamente sensibile per misurare il materiale immunoreattivo totale per la proinsulina nel siero o nel plasma. Il test era basato su due anticorpi monoclonali, un anticorpo anti-peptide C legato alla piastra per microtest e un anticorpo anti- insulina marcato con biotina .
- Il limite di rilevamento (3 DS sopra lo zero) nel tampone era 0,05 pmol/L, corrispondente a 0,25 pmol/L nel siero umano (diluito 1:5). L’intervallo del calibratore lineare era 0,05-20 pmol/L. Il CV intertest era del 4,7% con una mediana (intervallo) di 2,3 pmol/L (1,4-2,8 pmol/L, n = 8), 6,7% a 5,1 pmol/L (3, 3-8,0 pmol/L, n = 8) e 8,7% a 10,0 pmol/L (8-12 pmol/L, n = 10). Il recupero analitico medio della proinsulina umana aggiunta (hPI) (2, 5 e 10 pmol/L) al siero è stata dell’84% (range 68-128%, n = 9).
- L’ insulina umana e il peptide C umano non hanno reagito in modo crociato rispettivamente a 5000 e 10000 pmol/L. I quattro principali intermedi di conversione della proinsulina erano del 65-99% reattivi: split (32-33) hPI 74%, des- (31,32) hPI 65%, split (65-66) hPI 78% e des (64,65) hPI 99% . Tutti i valori sierici di 38 soggetti sani a digiuno erano al di sopra del limite di rilevabilità: mediana (intervallo) 4,0 (2,1-12,6) pmol/L.
Stabilire RT-PCR in tempo reale per determinare le quantità assolute di espressione genica IGF-I e IGF-II nel fegato e nei siti di tiloterapia extraepatica.
- Abbiamo sviluppato una singola provetta RT-PCR a due temperature in tempo reale che consente la quantificazione assoluta dell’espressione genica dell’ormone utilizzando il metodo della curva standard.
- Poiché la nostra ricerca si concentra sull’espressione dei fattori di crescita simili all’insulina (IGF) nel pesce osseo, abbiamo sviluppato la tecnica IGF-I e IGF-II utilizzando la tilapia (Oreochromis niloticus) come specie modello .
- Come approccio, abbiamo utilizzato l’estensione del primer aggiungendo il promotore della polimerasi fagica T7 (21 nt) all’estremità 5 ‘dei primer antisenso. Questa procedura evita gli svantaggi del plasmide.
- L’RNA totale estratto dal fegato è stato sottoposto a RT-PCR convenzionale per creare modelli per la trascrizione in vitro di IGF-I e IGF-II cRNA.
- Sono state verificate le dimensioni corrette dei modelli, incluso il promotore T7 (IGF-I: 91 nt; IGF-II: 94 nt). I prodotti della PCR sono stati utilizzati per generare cRNA IGF-I e IGF-II che sono stati quantificati mediante confronto punto macchia con quantità specificate di mRNA standardizzato di kanamicina.
- I valori di soglia del ciclo standardizzato (Ct) per gli mRNA di IGF-I e IGF-II sono stati raggiunti mediante RT-PCR in tempo reale e utilizzati per generare curve standard.
- Per consentire la normalizzazione del campione, è stata anche stabilita una curva standard per la beta-actina come calibratore interno (standard: 86 nt) e sono stati eseguiti esperimenti di convalida che mostrano un’efficienza di amplificazione simile per i geni target e di riferimento.
- Sulla base delle curve standard, sono state determinate le quantità assolute di IGF-I e IGF-II mRNA per il fegato (IGF-I: 8,90 +/- 1,90 pg / microgrammo di RNA totale, IGF-II: 3,59 +/- 0,98 pg / microgen total RNA) e siti extraepatici come cuore, rene, intestino, milza, branchie, gonadi e cervello, tenendo conto delle diverse lunghezze di cRNA e mRNA mediante fattori correttivi.
- La credibilità del metodo è stata confermata in ulteriori esperimenti.
- L’amplificazione delle diluizioni decrescenti del cRNA del fegato e dell’RNA totale ha prodotto pendenze parallele delle curve di amplificazione.
- Inoltre, i grafici di amplificazione dell’mRNA di cRNA e IGF-I e IGF-II standard hanno mostrato segnali che iniziano con i valori Ct attesi. Pertanto, la RT-PCR a provetta singola qui descritta è molto sensibile (livello di rilevamento di circa 2 µg/micron di RNA totale) e consente un’accurata quantificazione assoluta.
- Il peptide C è un marker della secrezione di insulina nei pazienti diabetici. Abbiamo valutato l’imprecisione intra e inter-laboratorio delle determinazioni del peptide C e determinato se i calibratori sierici con valori assegnati dalla spettrometria di massa potessero essere utilizzati per armonizzare i risultati del peptide C.
- Abbiamo inviato 40 diversi campioni di siero a 15 laboratori che hanno utilizzato 9 diversi metodi di routine del peptide C. Abbiamo anche inviato campioni di plasma abbinati a un altro laboratorio per l’analisi del peptide C utilizzando il metodo della spettrometria di massa di riferimento. Ciascun laboratorio ha analizzato 8 di questi campioni in duplicato in ciascuno dei 4 giorni per valutare l’imprecisione nel corso della giornata e tra giorni. Gli stessi 8 campioni sono stati utilizzati anche per normalizzare i risultati per i campioni rimanenti al metodo di spettrometria di massa di riferimento.
- I CV durante e tra le corse variavano rispettivamente da <2% a> 10% e da <2% a> 18%. La standardizzazione dei risultati con campioni di siero ha notevolmente migliorato la comparabilità tra laboratori e metodi. Dopo la normalizzazione, le differenze interlaboratorio nella risposta media non erano più statisticamente significative (P = 0,24), con i quadrati più piccoli.
- I risultati per il peptide C ottenuti con metodi e laboratori diversi non sono sempre coerenti, specialmente a concentrazioni più elevate di peptide C. Anche l’imprecisione all’interno del laboratorio è stata varia e alcuni metodi hanno fornito risultati molto più coerenti di altri. Questi dati mostrano che la calibrazione della misurazione del peptide C con un metodo di riferimento può aumentare la comparabilità tra laboratori.
Valutazione di saggi radioimmunologici disponibili in commercio e di ELISA specie-specifici per la misurazione di alte concentrazioni di insulina nei cavalli.
- Valutazione del saggio radioimmunologico umano (RIA) e degli ELISA specifici per specie equina e suina (hrp) per misurare i livelli sierici elevati di insulina nei pony.
- Campioni di siero di 12 pony sani non obesi (7 clinicamente normali e 5 suscettibili alla laminite; da 13 a 26 anni; 11 cavalle e 1 castrone) prima e dopo la somministrazione di glucosio, insulina e desametasone
- Sono state valutate la riproducibilità intra e inter-saggio, la stabilità congelamento-scongelamento, il parallelismo delle diluizioni e la coerenza del saggio
- I limiti di rilevamento del test erano i seguenti: RIA, <389 µU/ml; ELISA di cavallo, <175 μU / ml; e hrp ELISA, da 293 a 8775 µU / ml. La ripetibilità media ± SD intra- e inter-test era: RIA 6,5 ± 5,1% e 74 ± 3,4%, rispettivamente; ELISA di cavallo, 10,6 ± 11,0% e 9,0 ± 4,6%; e HR ELISA, 19,9 172% e 173 16,6%.
- Il congelamento e lo scongelamento hanno influenzato le concentrazioni misurate . Il parallelismo delle diluizioni nella RIA era evidente solo quando come diluente veniva utilizzato siero di cavallo impoverito di insulina (recupero percentuale 95,7 ± 274%); nei test ELISA è stato osservato il parallelismo delle diluizioni quando è stato utilizzato il calibratore in bianco.
- La coerenza dei risultati RIA con l’ELISA equino era buona per i campioni contenenti concentrazioni <175 μU di insulina / mL (deviazione, -18,5 ± 25,5 μU / mL; maggiore nella RIA). A concentrazioni più elevate, la concordanza del test era scarsa tra i risultati RIA ed ELISA equino (deviazione, -185,3 ± 98,7 μU / mL) e tra i risultati RIA e ELISA hrp (deviazione, 25,3 ± 183,0 μU / mL).
CA19-9 Calibrator Grade Protein |
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| abx061026-50kU | Abbexa | 50 kU | 523 EUR |
CA19-9 Calibrator Grade Protein |
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| abx061027-50kU | Abbexa | 50 kU | 523 EUR |
Recombinant CEA Protein (Calibrator Grade) |
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| VAng-Wyb8648-inquire | Creative Biolabs | inquire | Ask for price |
BSA Calibrator [Bradford Assay Kit] |
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| 0209C | AthenaES | 0.5 ml | 103 EUR |
Human Serum calibrator 3 (2X) |
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| 35-S63010000-L4 | Fitzgerald | 10 ml | 127 EUR |
Human Serum calibrator 3 (2X) |
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| 35-S7703H000-L3 | Fitzgerald | 10 ml | 122 EUR |
Cardiac Troponin I Calibrator Set |
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| 35R-AT01 | Fitzgerald | set | 1272 EUR |
Insulin B (9-23) |
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| 5-01395 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
Insulin Receptor (1142-1153) |
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| 5-01396 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Insulin, human recombinant (Yeast) |
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| 4773-5 | Biovision | 398 EUR | |
Troponin I Cardiac Calibrator Set Protein |
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| abx060754-1Set | Abbexa | 1 Set | 2054 EUR |
Human Lipoprotein (a) Calibrator 3 Protein |
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| abx060886-5ml | Abbexa | 5 ml | 342 EUR |
Human CA125 LCR Calibrator Grade Protein |
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| abx060963-50kU | Abbexa | 50 kU | 718 EUR |
Human CA125 LCR Calibrator Grade Protein |
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| abx060964-50kU | Abbexa | 50 kU | 718 EUR |
Human CA125 LCR Calibrator Grade Protein |
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| abx060971-50kU | Abbexa | 50 kU | 718 EUR |
IL-8 (-5 to +5) |
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| 5-01377 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Biotin-Insulin Receptor (1142-1153) |
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| 5-00795 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Insulin Receptor (1142 - 1153), Amide |
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| 5-01397 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Insulin, human recombinant (E. coli) |
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| 4772-5 | Biovision | 207 EUR | |
2',3',5'-triacetyl-5-Azacytidine |
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| C4119-5 | ApexBio | 5 mg | 118 EUR |
2',3',5'-triacetyl-5-Azacytidine |
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| B2822-5 | Biovision | 153 EUR | |
Human Apolipoprotein AI / B Calibrator 3 Protein |
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| abx060868-10ml | Abbexa | 10 ml | 676 EUR |
Human CA15-3 LCR Calibrator Grade Protein |
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| abx060966-50kU | Abbexa | 50 kU | 1511 EUR |
Histatin 5 |
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| 5-01307 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
5-Iodotubercidin |
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| A3125-5 | ApexBio | 5 mg | 168 EUR |
5-ROX |
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| B8212-5 | ApexBio | 5 mg | 195 EUR |
GNF-5 |
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| B1329-5 | Biovision | 142 EUR | |
Necrostatin-5 |
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| 1865-5 | Biovision | 126 EUR | |
Aftin-5 |
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| 2575-5 | Biovision | 457 EUR | |
CHD-5 |
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| 2693-5 | Biovision | 153 EUR | |
Insulin Like Protein 5 (INSL5) Antibody |
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| 20-abx172946 | Abbexa |
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Insulin Like Protein 5 (INSL5) Antibody |
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| 20-abx129590 | Abbexa |
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Insulin Like Protein 5 (INSL5) Antibody |
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| 20-abx216247 | Abbexa |
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Insulin Like Protein 5 (INSL5) Antibody |
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| 20-abx176997 | Abbexa |
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Insulin Like Protein 5 (INSL5) Antibody |
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| 20-abx176998 | Abbexa |
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Insulin Like Protein 5 (INSL5) Antibody |
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| 20-abx176999 | Abbexa |
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Recombinant Insulin Like Protein 5 (INSL5) |
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| 4-RPD875Mu01 | Cloud-Clone |
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Human Insulin ELISA Kit |
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| MET-5063-5 | Cell Biolabs | 5 x 96 assays | 2283 EUR |
Biotin-Insulin Receptor (1142-1153), amide |
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| 5-00796 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Insulin Receptor (1142 - 1153), pTyr1150, Biotinylated |
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| 5-01398 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
Kinase Domain of Insulin Receptor (1) |
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| 5-01425 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Kinase Domain of Insulin Receptor (2) |
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| 5-01426 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Kinase Domain of Insulin Receptor (3) |
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| 5-01427 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
Kinase Domain of Insulin Receptor (4) |
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| 5-01428 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
Thrombin Receptor Activator for Peptide 5 (TRAP-5) |
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| A1036-5 | ApexBio | 5 mg | 102 EUR |
TRAP-5 amide |
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| 5-02019 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
[Cit5]-TRAP-5 |
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| 5-00062 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
A-VI-5 |
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| 5-00524 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
ACTH(5-10) |
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| 5-00605 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Angiotensin (1-5) |
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| 5-00676 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Bradykinin (1-5) |
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| 5-00852 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
W-5 hydrochloride |
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| B6277-5 | ApexBio | 5 mg | 116 EUR |
5-Nonyloxytryptamine oxalate |
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| B6496-5 | ApexBio | 5 mg | 154 EUR |
5'-deoxy Thymidine |
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| C4692-5 | ApexBio | 5 mg | 180 EUR |
Teicoplanin A2-5 |
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| C4938-5 | ApexBio | 5 mg | 1157 EUR |
5-fluoro 203 |
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| C4114-5 | ApexBio | 5 mg | 154 EUR |
2',5'-Dideoxyadenosine |
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| 2770-5 | Biovision | 240 EUR | |
Biotin-Kinase Domain of Insulin Receptor (2) |
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| 5-00798 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Insulin-like Growth Factor I (57-70) |
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| 5-01399 | CHI Scientific | 4 x 5mg | Ask for price |
Insulin-Like Growth Factor II (69-84) |
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| 5-01400 | CHI Scientific | 4 x 1mg | Ask for price |
Mouse Insulin Like Protein 5 (INSL5) Protein |
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| 20-abx167845 | Abbexa |
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Human Insulin Like Protein 5 (INSL5) Protein |
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| 20-abx653879 | Abbexa |
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OVA Conjugated Insulin Like Protein 5 (INSL5) |
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| 4-CPD875Hu21 | Cloud-Clone |
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Pig Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E07I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Pig Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E07I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Pig Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E07I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
Dog Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E08I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Dog Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E08I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Dog Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E08I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
Goat Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E06I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Goat Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E06I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Goat Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E06I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
Mouse Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E03I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Mouse Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E03I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Mouse Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E03I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
Rabbit Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E04I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Rabbit Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E04I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Rabbit Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E04I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
Rat Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E02I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Rat Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E02I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Rat Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E02I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
Human Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E01I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Human Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E01I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Human Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E01I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
Monkey Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E09I0118-192T | BlueGene | 192 tests | 1270 EUR |
Monkey Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E09I0118-48 | BlueGene | 1 plate of 48 wells | 520 EUR |
Monkey Insulin Like Protein 5 ELISA kit |
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| E09I0118-96 | BlueGene | 1 plate of 96 wells | 685 EUR |
5-Formylcytosine (5-fC) ELISA Kit |
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| MET-5102-5 | Cell Biolabs | 5 x 96 assays | 2283 EUR |
5-Carboxylcytosine (5-caC) ELISA Kit |
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| MET-5103-5 | Cell Biolabs | 5 x 96 assays | 2283 EUR |
ELISA kit for Human Insulin-like peptide INSL5,Insulin-like peptide 5 |
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| EK2663 | SAB | 96 tests | 553 EUR |
La concordanza dei risultati dei 3 test è stata variabile e il parallelismo delle diluizioni è stato evidente solo con il RIA quando è stato testato il siero di cavallo depleto di insulina. Si consiglia cautela quando si valutano livelli elevati di insulina misurati dai test RIA o ELISA .