by Effetto della mancata corrispondenza del modello di primer sul rilevamento e sulla quantificazione degli acidi nucleici utilizzando il test della 5′-nucleasi.La reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale è attualmente il metodo di scelta per il rilevamento e la quantificazione degli acidi nucleici, in particolare nella diagnostica molecolare. La complementarità di primer e template è spesso cruciale nelle applicazioni PCR poiché le discrepanze possono ridurre gravemente l’efficienza dei primer.
- Tuttavia, sono disponibili pochi dati quantitativi sugli effetti di questi disallineamenti. Abbiamo quantificato l’effetto della mancata corrispondenza del modello di primer nella regione del primer di estremità 3′ sulla PCR in tempo reale utilizzando un’analisi della nucleasi 5′. I nostri risultati mostrano che le singole non conformità producono un’ampia gamma di effetti, che vanno da minori (soglia di ciclo <1,5, es. AC, CA, TG, GT) a grave (soglia di ciclo > 7,0, es. AA, GA, AG, CC). ) sull’amplificazione PCR.
- C’era una chiara relazione tra i tipi specifici di disadattamento, posizione ed effetto che sono rimasti coerenti per l’amplificazione del DNA rispetto all’RNA e al virus della leucemia murina Taq / Moloney rispetto alle amplificazioni basate su rTth.
- L’entità complessiva dell’interazione tra le diverse miscele primarie utilizzate variava considerevolmente (fino a sette volte) ed è stata osservata un’interazione all’indietro o sinistra specifica del primer per alcune miscele principali , sottolineando l’importanza delle condizioni sperimentali utilizzate .
- Presi insieme, questi dati suggeriscono che l’effetto del disadattamento segue uno schema coerente e ci ha permesso di formulare alcune linee guida per la previsione del comportamento di disadattamento del modello primer utilizzando miscele specifiche dei principali saggi di 5-nucleasi .
- Il nostro studio fornisce nuove informazioni sul comportamento di mancata corrispondenza e dovrebbe consentire uno sviluppo di test PCR in tempo reale più ottimizzato per le discrepanze di primer e modelli.
Confronto multipiattaforma di dieci master mix commerciali per il rilevamento della reazione a catena della polimerasi in tempo reale sulla base di campionatori di bioterrorismo per la preparazione alle sovratensioni.
- I Centers for Disease Control and Prevention e l’Infectious Disease Research Institute dell’esercito americano hanno sviluppato test PCR in tempo reale per rilevare agenti che minacciano il bioterrorismo. Tutti questi test si basano su un numero limitato di mastermix PCR in tempo reale convalidati.
- Poiché la disponibilità di questi reagenti è una componente fondamentale della preparazione al bioterrorismo, abbiamo intrapreso un esercizio di preparazione congiunto a livello nazionale per soddisfare il potenziale aumento delle esigenze dovute al rischio biologico su larga scala.
- Abbiamo identificato 9 potenziali alternative sul mercato al master mix approvato esistente (LightCycler FastStart DNA Master HybProbes): Taq Man Fast Universal PCR Master Mix, OmniMix HS, FAST qPCR Master Mix , EXPRESS qPCR SuperMix Kit, QuantiFast Probe PCR Kit, LightCycler FastStart DNA Master (PLUS) HybProbe, miscela Brilliant II FAST qPCR, miscela ABSolute Fast QPCR e
- HotStart IT Taq mix principale . Le prestazioni di questi kit sono state valutate mediante test PCR in tempo reale per quattro minacce bioterrorismo: Bacillus anthracis, Brucella melitensis, Burkholderia mallei e Francisella tularensis.
- Le miscele master sono state confrontate per i livelli di rilevamento specifici del target e per la coerenza dei risultati tra tre diverse piattaforme PCR in tempo reale (LightCycler, SmartCycler e 7500 Fast Dx).
- L’analisi PCR in tempo reale ha mostrato che tutti e dieci i kit si sono comportati bene al rilevamento dei fattori sul 7500 Fast Dx; tuttavia, il kit QuantiFast Probe PCR ha prodotto i risultati più costantemente positivi su più piattaforme PCR in tempo reale.
- Segnaliamo che alcune combinazioni di master mix e strumenti comunemente usati non sono affidabili come altri nel rilevare basse concentrazioni di DNA bersaglio. Inoltre, il nostro studio consente ai laboratori di scegliere tra i kit commerciali che valutiamo in base alle loro esigenze di preparazione.
Sviluppo di una reazione a catena in tempo reale della polimerasi 16S rDNA universale controllata internamente con potenziamento della monoazide di etidio per il rilevamento della contaminazione batterica nei concentrati piastrinici.
- La contaminazione batterica dei concentrati piastrinici (PLT) rimane un problema per i servizi di trasfusione di sangue. Sono disponibili tecniche di screening per i batteri basate sulla coltura, ma offrono velocità e sensibilità insufficienti. Sono state descritte tecniche alternative basate sull’amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR), ma le loro prestazioni sono spesso compromesse da tracce di DNA batterico nei reagenti.
- I primer universali 16S rDNA sono stati utilizzati per sviluppare un test PCR in tempo reale ( Taq Man, Applied Biosystems) e sono state studiate varie strategie per la decontaminazione dei reagenti. La sensibilità del rilevamento è stata valutata aggiungendo concentrati PLT con concentrazioni note di 13 organismi diversi.
- La digestione con enzimi di restrizione, l’ ultrafiltrazione del mastermix e l’uso di Taq polimerasi hanno ridotto in una certa misura il livello di contaminazione del DNA del reagente, ma tutti si sono rivelati inaffidabili. Al contrario, il trattamento della mastermix PCR con monoazide di etidio (EMA) seguito da fotoattivazione è stato affidabile ed efficace, consentendo 40 cicli completi di amplificazione ed eliminando completamente la contaminazione senza compromettere la sensibilità del test. Tutti i 13 organismi sono stati rilevati con successo e il limite di rilevamento per PLT arricchito con Escherichia coli era di circa 1 unità formante colonia/ml.
- La co-amplificazione del DNA mitocondriale umano è stata utilizzata per confermare la riuscita estrazione degli acidi nucleici e l’assenza di inibizione della PCR in ciascun campione. Una delle cinque piattaforme di estrazione automatizzate valutate è risultata priva di contaminanti e in grado di elaborare un’elevata produttività.
Le librerie metagenomiche virali sono una fonte promettente ma precedentemente non sfruttata di nuovi enzimi reagenti.
- Il sequenziamento profondo e lo screening funzionale del DNA metagenomico virale da un pool termale quasi bollente hanno identificato i cloni che esprimono l’attività della DNA polimerasi termostabile (Pol).
- Tra questi, 3173 Pol ha mostrato sia un’elevata termostabilità che un’attività innata della trascrittasi inversa (RT). Descriviamo la biochimica di 3173 Pol e ne descriviamo l’uso nella PCR a trascrizione inversa a singolo enzima (RT-PCR). 3173 Pol di tipo selvaggio contiene un dominio correttore di esonucleasi 3′-5′ che fornisce un’elevata precisione nella PCR. Un derivato carente di esonucleasi più facile da usare è stato incorporato in a
- Master mix PyroScript RT-PCR e confronto con sistemi RT-PCR monoenzimatici (Tth) e a doppio enzima (MMLV RT / Taq ) per la determinazione quantitativa dell’RNA target MS2, dell’RNA A dell’influenza e dell’mRNA. La specificità e la sensibilità della RT-PCR basata su 3173 Pol erano superiori alla Tth Pol e paragonabili ai tre comuni sistemi a doppio enzima. L’efficienza e la configurazione semplificata rendono questo enzima una potenziale alternativa alla ricerca molecolare e alla diagnostica.
Ottimizzazione del metodo di amplificazione isotermica per il rilevamento e la visualizzazione di Mycobacterium tuberculosis per il lavoro sul campo.
- <AbstractText> La tubercolosi è ancora una delle malattie più contagiose al mondo. I fattori chiave nel controllo della tubercolosi sono la diagnosi tempestiva, il trattamento efficace e la prevenzione delle infezioni attraverso la sorveglianza e il monitoraggio. Tuttavia, l’allevamento è il gold standard nella diagnosi di laboratorio della tubercolosi; i risultati sono disponibili in poche settimane. Al fine di prevenire l’infezione da tubercolosi, la diagnosi dovrebbe essere fatta il prima possibile e il trattamento iniziato il prima possibile.
- Lo scopo di questo studio è ottimizzare il metodo di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), che fornisce un risultato molto più veloce e più sensibile rispetto al metodo PCR e consente la replicazione delle sequenze di acido nucleico bersaglio in condizioni isoterme senza la necessità di infrastrutture di laboratorio. </AbstractText> <AbstractText> I campioni di espettorato sono stati omogeneizzati con il 5% di tripsina in CaCl2 per ottenere il DNA. Il DNA è stato purificato utilizzando il mini kit QIAGEN QIAamp DNA.
- I primer LAMP sono stati progettati utilizzando Primer explorer V5 in conformità con il gene Mycobacterium tuberculosis IS6110. Per la reazione LAMP è stato utilizzato il kit NEB Bst 3.0 per la DNA polimerasi. Inoltre, le reazioni LAMP sono state confrontate con la <em> Taq </em> RT-PCR basata sull’uomo utilizzando il kit della polimerasi <em> Taq </em> di NEB. Infine, per la visualizzazione dei prodotti LAMP, aste di misura del flusso laterale prodotte da Milenia Biotec, miscele colorimetriche <em> 2X </em> LAMP <em> master </em> prodotte da NEB e metodi di elettroforesi su gel di agarosio% 2 w / v sono stati utilizzati.</AbstractText>
2 × Taq Plus Master Mix |
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| P211-02 | Vazyme | 15 ml | 193 EUR |
2 × Taq Plus Master Mix |
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| P211-03 | Vazyme | 50 ml | 389 EUR |
2 × Rapid Taq Master Mix |
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| P222-01 | Vazyme | 5 ml (5×1ml) | 120 EUR |
2 × Rapid Taq Master Mix |
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| P222-02 | Vazyme | 15 ml (15×1ml) | 153 EUR |
2 × Rapid Taq Master Mix |
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| P222-03 | Vazyme | 50 ml (50 x 1 ml) | 257 EUR |
2 × Rapid Taq Master Mix |
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| P222-04 | Vazyme | 50 ml (10×5ml) | 257 EUR |
Accuris Taq Plus Master Mix |
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| PR1001-TP-1000 | Benchmark Scientific | 1 PC | 827.41 EUR |
Accuris Taq Plus Master Mix |
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| PR1001-TP-200 | Benchmark Scientific | 1 PC | 242.84 EUR |
Accuris Taq Plus Master Mix |
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| PR1001-TP-S | Benchmark Scientific | 1 PC | 69.79 EUR |
Taq 2x PCR Mix 100 rxn |
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| BA01501 | Bioatlas | 100rxn | 94 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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| P7000-005 | GenDepot | 5x1 ml | 219 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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| P7000-010 | GenDepot | 10x1 ml | 317 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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| P7000-050 | GenDepot | 50x1 ml | 1211 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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| P7000-100 | GenDepot | 100x1 ml | 2102 EUR |
Pfu 2x Master Mix - 200 Reactions |
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| 3326 | Intact Genomics | 1/EA | 300 EUR |
Gloria Nova HS 2x Master Mix |
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| RK20717 | Abclonal | 1mL | Ask for price |
Entrans 2X qPCR Probe Master Mix |
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| RK21208 | Abclonal | 40 RXN | Ask for price |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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| B21202 | Bimake | 5 mL | 224 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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| B21203 | Bimake | 25 mL | 856 EUR |
2xEs Taq Master Mix (with Dyes) |
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| W0690-1 | 101Bio | - | Ask for price |
2xEs Taq Master Mix (with Dyes) |
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| W0690-5 | 101Bio | - | Ask for price |
2× EpiArt HS Taq Master Mix |
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| EM201-01 | Vazyme | 1ml | 145 EUR |
2× EpiArt HS Taq Master Mix |
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| EM201-02 | Vazyme | 5 ml (5×1ml) | 303 EUR |
2× EpiArt HS Taq Master Mix |
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| EM201-03 | Vazyme | 15 ml (15×1ml) | 642 EUR |
2 × Taq Master Mix (Dye Plus) |
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| P112-01 | Vazyme | 5 ml | 117 EUR |
2 × Taq Master Mix (Dye Plus) |
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| P112-02 | Vazyme | 15 ml | 146 EUR |
2 × Taq Master Mix (Dye Plus) |
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| P112-03 | Vazyme | 50 ml | 236 EUR |
Accuris Hot Start Taq Master Mix |
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| PR1001-HS-1000 | Benchmark Scientific | 1 PC | 490.87 EUR |
Accuris Hot Start Taq Master Mix |
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| PR1001-HS-200 | Benchmark Scientific | 1 PC | 169.47 EUR |
Accuris Taq Master Mix Red Dye |
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| PR1001-R-1000 | Benchmark Scientific | 1 PC | 300.26 EUR |
Accuris Taq Master Mix Red Dye |
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| PR1001-R-200 | Benchmark Scientific | 1 PC | 121.62 EUR |
Accuris Taq Master Mix Red Dye |
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| PR1001-R-S | Benchmark Scientific | 1 PC | 69.79 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0342-010 | GenDepot | 2x50 rxns | 253 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0342-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 455 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0342-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 779 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0342-100 | GenDepot | 20x50 rxns | 1333 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0346-001 | GenDepot | 1ml | 280 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0346-002 | GenDepot | 2x1ml | 482 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0346-005 | GenDepot | 5x1ml | 828 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0346-010 | GenDepot | 10x1ml | 1360 EUR |
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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| BS9291 | Bio Basic | 5X1mL, 5ml | 209.5 EUR |
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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| BS9292 | Bio Basic | 1ml | 96.4 EUR |
2×Taq PCR Master Mix(with dye) |
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| K1034-1 | ApexBio | 1 ml | 73 EUR |
2×Taq PCR Master Mix(with dye) |
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| K1034-100 | ApexBio | 100×1 ml | 792 EUR |
2×Taq PCR Master Mix(with dye) |
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| K1034-20 | ApexBio | 20×1 ml | 282 EUR |
2×Taq PCR Master Mix(with dye) |
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| K1034-5 | ApexBio | 5×1 ml | 119 EUR |
2×Taq PCR Master Mix(with dye) |
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| K1034-50 | ApexBio | 50×1 ml | 514 EUR |
2 × Taq Plus Master Mix (Dye Plus) |
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| P212-01 | Vazyme | 5 ml | 133 EUR |
2 × Taq Plus Master Mix (Dye Plus) |
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| P212-02 | Vazyme | 15 ml | 193 EUR |
2 × Taq Plus Master Mix (Dye Plus) |
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| P212-03 | Vazyme | 50 ml | 389 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5601-001 | GenDepot | 1ml | 146 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5601-002 | GenDepot | 2x1ml | 207 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5601-005 | GenDepot | 5x1ml | 266 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5601-010 | GenDepot | 10x1ml | 442 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5601-050 | GenDepot | 50x1ml | 1670 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5701-001 | GenDepot | 1ml | 174 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5701-002 | GenDepot | 2x1ml | 266 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5701-005 | GenDepot | 5x1ml | 469 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5701-010 | GenDepot | 10x1ml | 739 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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| Q5701-050 | GenDepot | 50x1ml | 2885 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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| B21402 | Bimake | 5 ml | 224 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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| B21403 | Bimake | 25 ml | 856 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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| B21702 | Bimake | 5 ml | 224 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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| B21703 | Bimake | 25 ml | 856 EUR |
2× EpiArt HS Taq Master Mix (Dye Plus) |
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| EM202-01 | Vazyme | 1ml | 145 EUR |
2× EpiArt HS Taq Master Mix (Dye Plus) |
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| EM202-02 | Vazyme | 5 ml (5×1ml) | 303 EUR |
2× EpiArt HS Taq Master Mix (Dye Plus) |
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| EM202-03 | Vazyme | 15 ml (15×1ml) | 642 EUR |
2 × Taq Plus Master Mix II (Dye Plus) |
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| P213-01 | Vazyme | 5 ml | 134 EUR |
2 × Taq Plus Master Mix II (Dye Plus) |
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| P213-02 | Vazyme | 15 ml | 193 EUR |
2 × Taq Plus Master Mix II (Dye Plus) |
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| P213-03 | Vazyme | 50 ml | 389 EUR |
Accuris Hot Start Taq Master Mix Red Dye |
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| PR1001-HSR-1000 | Benchmark Scientific | 1 PC | 490.87 EUR |
Accuris Hot Start Taq Master Mix Red Dye |
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| PR1001-HSR-200 | Benchmark Scientific | 1 PC | 169.47 EUR |
Accuris Hot Start Taq Master Mix Red Dye |
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| PR1001-HSR-S | Benchmark Scientific | 1 PC | 69.79 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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| Q5600-001 | GenDepot | 1ml | 146 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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| Q5600-002 | GenDepot | 2x1ml | 207 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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| Q5600-005 | GenDepot | 5x1ml | 269 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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| Q5600-010 | GenDepot | 10x1ml | 448 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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| Q5600-050 | GenDepot | 50x1ml | 1738 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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| Q5602-001 | GenDepot | 1ml | 146 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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| Q5602-002 | GenDepot | 2x1ml | 207 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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| Q5602-005 | GenDepot | 5x1ml | 266 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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| Q5602-010 | GenDepot | 10x1ml | 442 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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| Q5602-050 | GenDepot | 50x1ml | 1670 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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| Q5603-001 | GenDepot | 1ml | 146 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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| Q5603-002 | GenDepot | 2x1ml | 207 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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| Q5603-005 | GenDepot | 5x1ml | 266 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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| Q5603-010 | GenDepot | 10x1ml | 442 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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| Q5603-050 | GenDepot | 50x1ml | 1670 EUR |
- <AbstractText> La temperatura di amplificazione ottimale per LAMP è risultata essere 71,4 °C. Il limite di rilevamento del metodo era di 102 CFU/ml e la sensibilità era del 100% rispetto a cinque diverse specie di Mycobacterium.</AbstractText>
- <AbstractText> L’attuale studio ha dimostrato che il protocollo LAMP-LFD e la LAMP colorimetrica ottimizzata con campioni di espettorato possono essere affidabili come test rapido, sensibile e specifico per la diagnosi della tubercolosi sul campo. </AbstractText>