Sistema di espressione eucariotica transitoria basato sul virus vaccinia ricombinante

1. Presentiamo la costruzione e l’uso di una serie di vettori plasmidici adatti per il rilevamento e la clonazione di segnali di controllo della traduzione e 5 ‘sequenze codificanti di geni di origine esogena.
2. In questi plasmidi, i primi otto codoni dell’amminoterminale del  gene beta  –  galattosidasi  dell’operone lattosio, lacZ, sono stati rimossi e gli esclusivi siti di scissione dell’endonucleasi BamHI, EcoRI e SmaI (XmaI) sono stati incorporati adiacenti all’ottavo codone di lacZ.
3. L’introduzione in tali plasmidi di fusione lac di frammenti di acido desossiribonucleico contenenti opportuni segnali regolatori e sequenze codificanti 5′ ha portato alla produzione di proteine ​​ibride costituite da un segmento residuo carbossi   -terminale beta  –  galattosidasi   e un frammento peptidico contenente il gruppo amminoacidico amino-terminale codificato da una sequenza esogena di acido desossiribonucleico.
4. Questi peptidi ibridi hanno mantenuto   l’ attività   enzimatica   beta  –  galattosidasi   e hanno dato il fenotipo Lac +. Tali proteine ​​ibride sono utili per la purificazione di sequenze peptidiche codificate da frammenti esogeni di acido desossiribonucleico e per studi sulla struttura e funzione di specifici segmenti peptidici.

Il DNA che codifica il batteriofago T7 RNA polimerasi è stato ligato al promotore della trascrizione del virus del vaccino e integrato nel genoma del virus del vaccino. Il virus vaccinale ricombinante ha mantenuto l’infettività e ha espresso stabilmente la T7 RNA polimerasi nelle cellule di mammifero  . I geni bersaglio sono stati costruiti inserendo segmenti di DNA che codificano per   beta  –  galattosidasi   o cloramfenicolo acetiltransferasi in un plasmide con le regioni del promotore e del terminatore del batteriofago T7.

Quando le cellule sono state infettate con virus vaccinia ricombinante e trasfettate con plasmidi contenenti geni bersaglio, questi ultimi sono stati espressi a livelli elevati. L’ attività del cloramfenicolo acetiltransferasi  era 400-600 volte maggiore di quella osservata nei sistemi di espressione transitoria dei mammiferi convenzionali regolati dal potenziatore e dalle regioni del promotore della ripetizione terminale lunga del virus del sarcoma di Rous o dalla regione iniziale del virus della scimmia. Il virus del vaccino ibrido / T7 costituisce la base di un sistema di espressione dei mammiferi semplice, rapido, ampiamente utilizzato ed efficiente.