Luglio 21, 2024

Sistema di espressione eucariotica transitoria basato sul virus vaccinia ricombinante

L’arresto del ciclo cellulare correlato a BRAFE600 ricorda il processo di invecchiamento delle voglie umane. La maggior parte delle cellule di mammiferi normali ha una durata limitata che si ritiene sia un meccanismo protettivo contro la proliferazione illimitata. Questo fenomeno, chiamato invecchiamento, è guidato dall’attrito dei telomeri, che innesca l’induzione di soppressori tumorali, incluso p16 (INK4a) (rif. 5). Nelle cellule in coltura, l’invecchiamento può essere indotto prematuramente dagli oncogeni; tuttavia, è stato a lungo dibattuto se tale invecchiamento indotto da oncogeni sia un processo fisiologico.

  • I nevi umani (talpe) sono neoplasie benigne dei melanociti che spesso contengono mutazioni oncogeniche (principalmente V600E dove la valina sostituisce l’acido glutammico) in BRAF, protein chinasi e l’effettore a valle di Ras.
  • Tuttavia, i nei di solito rimangono rachitici per decenni e raramente si sviluppano in un tumore maligno (melanoma). Ciò solleva la questione se il nevo sia l’invecchiamento indotto da BRAF (V600E).
  • Qui vi mostriamo che l’espressione sostenuta di BRAF (V600E) nei melanociti umani induce l’arresto del ciclo cellulare accompagnato dall’induzione sia dell’attività di p16 (INK4a) che della   beta  –  galattosidasi acida  correlata all’invecchiamento   (SA  – beta –  Gal), un marker di invecchiamento comunemente usato.
  • Dopo la convalida di questi risultati in vivo, i nei congeniti sono invariabilmente positivi per SA  -beta-  Gal, indicando la presenza di questo classico marker dell’invecchiamento in una lesione neoplastica umana in gran parte rachitica. Nei melanociti con inibizione della crescita,  sia in vitro che in situ, abbiamo osservato una marcata induzione a mosaico di p16 (INK4a), suggerendo che fattori diversi da p16 (INK4a) contribuiscono alla protezione contro la proliferazione mediata da BRAF (V600E).
  • Naevi non sembra soffrire di abrasione dei telomeri, sostenendo un processo di invecchiamento attivo guidato dagli oncogeni piuttosto che una perdita del potenziale di replicazione.
  • Pertanto, sia in vitro che in vivo, i melanociti che esprimono BRAF (V600E) mostrano i classici segni dell’invecchiamento, suggerendo che l’invecchiamento indotto dall’oncogene rappresenta un vero processo fisiologico protettivo.

Fusioni geniche in vitro che collegano un  segmento beta  –  galattosidasi enzimaticamente attivo   con frammenti all’amminoterminale di proteine ​​esogene: vettori plasmidici di Escherichia coli per il rilevamento e la clonazione dei segnali di inizio della traduzione.

  1. Presentiamo la costruzione e l’uso di una serie di vettori plasmidici adatti per il rilevamento e la clonazione di segnali di controllo della traduzione e 5 ‘sequenze codificanti di geni di origine esogena.
  2. In questi plasmidi, i primi otto codoni dell’amminoterminale del  gene beta  –  galattosidasi  dell’operone lattosio, lacZ, sono stati rimossi e gli esclusivi siti di scissione dell’endonucleasi BamHI, EcoRI e SmaI (XmaI) sono stati incorporati adiacenti all’ottavo codone di lacZ.
  3. L’introduzione in tali plasmidi di fusione lac di frammenti di acido desossiribonucleico contenenti opportuni segnali regolatori e sequenze codificanti 5′ ha portato alla produzione di proteine ​​ibride costituite da un segmento residuo carbossi   -terminale beta  –  galattosidasi   e un frammento peptidico contenente il gruppo amminoacidico amino-terminale codificato da una sequenza esogena di acido desossiribonucleico.
  4. Questi peptidi ibridi hanno mantenuto   l’ attività   enzimatica   beta  –  galattosidasi   e hanno dato il fenotipo Lac +. Tali proteine ​​ibride sono utili per la purificazione di sequenze peptidiche codificate da frammenti esogeni di acido desossiribonucleico e per studi sulla struttura e funzione di specifici segmenti peptidici.

Il DNA che codifica il batteriofago T7 RNA polimerasi è stato ligato al promotore della trascrizione del virus del vaccino e integrato nel genoma del virus del vaccino. Il virus vaccinale ricombinante ha mantenuto l’infettività e ha espresso stabilmente la T7 RNA polimerasi nelle cellule di mammifero  . I geni bersaglio sono stati costruiti inserendo segmenti di DNA che codificano per   beta  –  galattosidasi   o cloramfenicolo acetiltransferasi in un plasmide con le regioni del promotore e del terminatore del batteriofago T7.

Quando le cellule sono state infettate con virus vaccinia ricombinante e trasfettate con plasmidi contenenti geni bersaglio, questi ultimi sono stati espressi a livelli elevati. L’ attività del cloramfenicolo acetiltransferasi  era 400-600 volte maggiore di quella osservata nei sistemi di espressione transitoria dei mammiferi convenzionali regolati dal potenziatore e dalle regioni del promotore della ripetizione terminale lunga del virus del sarcoma di Rous o dalla regione iniziale del virus della scimmia. Il virus del vaccino ibrido / T7 costituisce la base di un sistema di espressione dei mammiferi semplice, rapido, ampiamente utilizzato ed efficiente.

Mappatura della segnalazione Wnt /  beta –  catenina durante lo sviluppo del topo e nei tumori del colon.

  1. La segnalazione della beta  -catenina Wnt gioca un ruolo chiave in diversi processi evolutivi e patologici. I domini di espressione Wnt sono stati ampiamente studiati nei topi, ma i tessuti che ricevono il segnale rimangono in gran parte non identificati.
  2. Per determinare quali cellule rispondono alla   beta  -catenina attivata durante lo sviluppo dei mammiferi, abbiamo generato un   transgene attivato dalla beta -catenina che dirige l’espressione di topi transgenici nucleari del  recettore  beta  –  galattosidasi   (BAT-gal) che esprimono il gene lacZ sotto il controllo di   beta  – elementi reattivi della catenina T al fattore cellulare.
  3. L’ attività del gene reporter  si trova in centri organizzativi noti come il bordo del mesencefalo e la cresta ectodermica della punta dell’arto. Inoltre, l’espressione BAT-gal identifica nuovi siti di segnalazione Wnt come il midollo dorsale, l’endotelio e le regioni del cervello adulto, rivelando un modello dinamico inaspettato   dell’attività trascrizionale  della beta –  catenina . L’espressione del transgene è stata analizzata su sfondi mutanti.
  4. Nei topi 6-null omozigoti legati al recettore delle lipoproteine ​​privi di un corecettore Wnt, la colorazione BAT-gal non è presente nei tessuti mutanti, indicando che i topi BAT-gal sono marcatori in buona fede della   segnalazione Wnt della beta -catenina in vivo.
  5. L’analisi dell’espressione di BAT-gal sullo sfondo della poliposi adenomatosa del colon (sviluppo del colon +) ha mostrato   l’attività trascrizionale della  beta –  catenina negli adenomi intestinali, ma sorprendentemente non nelle normali cellule della cripta.
  6. Nel complesso, i topi BAT-gal rivelano l’intera complessità della  segnalazione Wnt beta –  catenina nei mammiferi e hanno un’ampia applicabilità per identificare una popolazione cellulare reattiva Wnt nello sviluppo e nella malattia.

Trappole promotrici nelle cellule staminali embrionali: screening genetico per l’identificazione e la mutazione dei geni dello sviluppo nei topi.

  • È stata sviluppata una strategia generale per selezionare le mutazioni di inserzione nei topi. I costrutti privi di un promotore e contenenti un  gene della beta  –  galattosidasi   o un gene reporter che codifica per una proteina con  attività sia della  beta     galattosidasi  che  della neomicina fosfotransferasi sono stati progettati in modo tale che l’attivazione del gene reporter dipendesse dal suo inserimento in un’unità di trascrizione attiva. Tali eventi inserzionali  creano una mutazione nel gene marcato e consentono alla sua espressione di essere seguita dall’attività   della  beta  –  galattosidasi   .
  • L’introduzione di costrutti di trappola del promotore nelle cellule staminali embrionali (ES) mediante elettroporazione o infezione retrovirale ha portato alla derivazione di linee transgeniche che esibiscono diversi  modelli di espressione della beta  –  galattosidasi.

Alpha Galactosidase (?-Gal) Activity Assay Kit (Fluorometric)

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Beta Galactosidase

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GAL | Beta galactosidase

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Beta galactosidase antibody

E39-10432 EnoGene 100ug/100ul 225 EUR

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Beta galactosidase antibody

70R-51282 Fitzgerald 100 ul 242 EUR

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Beta Galactosidase Antibody

MBS5315899-01mL MyBiosource 0.1mL 470 EUR

Beta Galactosidase Antibody

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Galactosidase Beta, Antibody

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Streptavidin (Beta Galactosidase)

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Streptavidin (Beta Galactosidase)

MBS634735-5x1mg MyBiosource 5x1mg 3235 EUR

MOUSE ANTI BETA GALACTOSIDASE

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beta D Galactosidase Antibody

abx022826-10mg Abbexa 10 mg 910.8 EUR

Beta D Galactosidase Antibody

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RABBIT ANTI BETA GALACTOSIDASE

MBS224940-01mg MyBiosource 0.1mg 580 EUR

RABBIT ANTI BETA GALACTOSIDASE

MBS224940-5x01mg MyBiosource 5x0.1mg 2435 EUR

Beta Galactosidase Staining Kit

55R-1541 Fitzgerald 250 assays 300 EUR

Beta Galactosidase Antibody (HRP)

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Chicken anti Beta Galactosidase

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MBS396758-5x01mg MyBiosource 5x0.1mg 1120 EUR

beta Galactosidase (GLB1) Antibody

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beta Galactosidase (GLB1) Antibody

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beta Galactosidase (GLB1) Antibody

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Beta Galactosidase (GLB1) Antibody

abx230877-100ug Abbexa 100 ug 610.8 EUR

beta Galactosidase (GLB1) Antibody

abx411927-01mg Abbexa 0.1 mg 710.4 EUR

beta Galactosidase (GLB1) Antibody

abx415199-02mg Abbexa 0.2 mg 678 EUR

anti- Beta galactosidase antibody

FNab00877 FN Test 100µg 658.5 EUR

Beta Galactosidase Antibody (FITC)

GWB-Q00624 GenWay Biotech 1 mg Ask for price

Anti- Beta Galactosidase Antibody

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Anti- Beta Galactosidase Antibody

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Anti- Beta Galactosidase Antibody

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Galactosidase beta Rabbit pAb

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MBS8540329-01mLAF635 MyBiosource 0.1mL(AF635) 565 EUR

beta Galactosidase antibody (biotin)

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beta Galactosidase antibody (biotin)

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MBS835000-5x2mg MyBiosource 5x2mg 975 EUR

Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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Galactosidase Beta (GLb) Antibody

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beta Galactosidase Blocking Peptide

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Avidin, Neutralite (Beta Galactosidase)

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Avidin, Neutralite (Beta Galactosidase)

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Rat Galactosidase Beta CLIA Kit

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Cat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Rat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Rat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Rat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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MBS726005-5x96StripWells MyBiosource 5x96-Strip-Wells 3020 EUR

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Rat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Rat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Rat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

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Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

RPA196Mu01 Cloud-Clone 10ug 152 EUR

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Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

RPA196Ra01 Cloud-Clone 10ug 177 EUR

Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

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Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

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Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

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Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

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Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

MBS2009828-02mg MyBiosource 0.2mg 490 EUR

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MBS2009828-05mg MyBiosource 0.5mg 930 EUR

Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

MBS2010015-001mg MyBiosource 0.01mg 170 EUR

Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

MBS2010015-005mg MyBiosource 0.05mg 305 EUR

Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

MBS2010015-01mg MyBiosource 0.1mg 465 EUR

Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

MBS2010015-02mg MyBiosource 0.2mg 565 EUR

Recombinant Galactosidase Beta (GLb)

MBS2010015-05mg MyBiosource 0.5mg 1070 EUR

Anti- Beta Galactosidase -HRP Antibody

GWB-2E0218 GenWay Biotech 10 mg Ask for price

Goat Galactosidase, Beta ELISA Kit

MBS022347-INQUIRE MyBiosource INQUIRE Ask for price

Fish Galactosidase, Beta ELISA Kit

MBS020498-INQUIRE MyBiosource INQUIRE Ask for price

Cavy Galactosidase, Beta ELISA Kit

MBS017081-INQUIRE MyBiosource INQUIRE Ask for price

Duck Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Goat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Goat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Goat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Goat Galactosidase, Beta ELISA Kit

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Anti- Beta Galactosidase -FITC Antibody

GWB-4A7530 GenWay Biotech 10 mg Ask for price

Rat Galactosidase Beta (GLb) Protein

20-abx066719 Abbexa
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Cow Galactosidase Beta (GLb) Protein

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Dog Galactosidase Beta (GLb) Protein

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Mouse Galactosidase, Beta ELISA Kit

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 L’ incrocio di eterozigoti da 24 ceppi che esprimono   beta  –  galattosidasi  ha consentito l’identificazione di 9 ceppi in cui l’omozigosi ha portato alla mortalità embrionale. Poiché non è stato rilevato alcun fenotipo palese nei ceppi rimanenti, questi risultati suggeriscono che una percentuale significativa dei geni dei mammiferi identificati da questo approccio non sono essenziali per lo sviluppo.

 

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