Luglio 3, 2022

Valutazione del trattamento HemogloBind per la preparazione di campioni per l’analisi della colinesterasi

Caratteristiche delle proteine ​​di membrana e degli eritrociti citosolici.Al fine di testare un’ampia coorte di campioni di eritrociti in un contesto clinico, questa sezione descrive in dettaglio un nuovo approccio che consente l’analisi sia del citosolico umano che dei subproteomi di membrana. Nonostante la sua struttura semplice, l’alto contenuto di emoglobina presente nei globuli rossi (RBC) rende estremamente difficile l’analisi del proteoma.

  • Sono state studiate a fondo varie strategie per isolare la membrana e le frazioni citosoliche dagli eritrociti e il loro effetto sul profilo del proteoma mediante 2-DE, con particolare attenzione alla rimozione dell’emoglobina.
  •  Di conseguenza, qui viene mostrato un approccio semplice, veloce e soddisfacente all’esaurimento dell’emoglobina nelle cellule eritrocitarie basato sul  reagente HemogloBind per un’analisi soddisfacente del sub-proteoma citosolico con 2-DE senza grandi interferenze.
  • Per il proteoma di membrana, è stata descritta una nuova strategia combinata basata sull’isolamento mediante lisi ipotonica e ulteriore purificazione in minicolonne, che consente il rilevamento di proteine ​​ad alto peso molecolare (cioè spettrina, ankyrin) e pattern 2-DE ben separati. L’analisi della frazione di membrana mediante il metodo nano-LC accoppiato con lo spettrometro di massa LTQ-Orbitrap consente l’identificazione di un totale di 188 proteine ​​uniche.

Quantificazione relativa della superossido dismutasi Cu-Zn glicata negli eritrociti mediante spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray.

  • La spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESIMS) è stata utilizzata per quantificare la superossido dismutasi Cu-Zn glicata (SOD-1) negli eritrociti umani. I campioni di SOD-1 sono stati preparati dai globuli rossi rimuovendo l’emoglobina utilizzando un  gel di emoglobina   seguita dall’estrazione con etanolo e cloroformio.
  • La riproducibilità della misurazione della percentuale relativa di proteina glicata era buona e la deviazione standard di ciascuna misurazione era del 4,0%. Sulla base dell’analisi dello spettro di massa di una miscela di SOD-1 commerciale e SOD-1 parzialmente glicata in vitro in diversi rapporti, è stato riscontrato che la SOD-1 libera e glicata aveva la stessa efficienza di ionizzazione.
  • La percentuale di glicazione su SOD-1 è stata misurata in 30 persone, compresi i pazienti diabetici. I livelli di glicazione  variavano dal 4,5% al ​​di sotto del limite di rilevamento.
  • Il campione SOD-1 estratto dagli eritrociti è stato frazionato mediante cromatografia Glyco-Gel B e le frazioni separate sono state analizzate mediante MS. Gli spettri di massa della frazione assorbita hanno mostrato quantità significative di legame non specifico di proteine ​​non glicate al Glyco-Gel B.

Intervalli di dosaggio e monitoraggio dell’emoglobina in pazienti con malattia renale cronica anemica trattati con epoetina alfa o darbepoetina alfa: uno studio di coorte retrospettivo.

  1. L’anemia è una complicanza comune della malattia renale cronica (CKD). L’intervallo di somministrazione approvato per gli stimolanti dell’eritropoiesi (ESA) attualmente disponibili è da 2 a 3 volte a settimana per l’epoetina alfa (EPO) e ogni 1 o 2 settimane per darbepoetina alfa (DARB). Tuttavia, per comodità, i medici a volte usano dosaggi meno frequenti.
  2. Questo studio ha studiato gli effettivi modelli di utilizzo dell’ESA (dosi e intervallo di somministrazione) e   il controllo dell’emoglobina (Hb)  in pazienti ambulatoriali adulti con insufficienza renale cronica che non richiedono dialisi presso la clinica per l’anemia della Cleveland Clinic Foundation. È stata anche studiata la distribuzione e la variabilità dei livelli di Hb in questi pazienti.
  3. Le cartelle cliniche e le registrazioni elettroniche di pazienti adulti con insufficienza renale cronica che hanno iniziato la terapia con ESA prima di marzo 2005 sono state riviste per determinare gli intervalli di dose iniziale, dominante (consecutivo più lungo) e finale e le dosi settimanali medie di EPO e DARB. Il controllo Hb è stato testato per le variazioni massime> 12 g / dL e <11 g / dL e la proporzione di misurazioni al di fuori di questi valori.
  4. L’analisi ha incluso i dati di 111 pazienti ambulatoriali (età media [DS] 65,9 [14,4] anni; 53,2% maschi; 66,7% bianchi, 29,7% neri, 2,7% altro 0,9% di etnia sconosciuta). Ventuno pazienti hanno ricevuto solo EPO, 74 solo DARB e 16 hanno sostituito ESA. Il follow-up medio è stato di 20,5 mesi. Le interruzioni iniziali della somministrazione più comuni sono state qwk per EPO (66,7%) e q2wk per DARB (90,5%). Gli intervalli di somministrazione dominanti erano ogni 2 settimane nel 61,9% dei pazienti con EPO e ogni 3 settimane nel 62,3% dei pazienti DARB. Tuttavia, l’80,0% di coloro che hanno ricevuto EPO q2wk e il 63,2% di coloro che hanno ricevuto DARB q3wk alla fine sono tornati agli intervalli di somministrazione iniziali. La percentuale più alta di misurazioni di Hb <11 g/dl si è verificata agli intervalli di dosaggio dominanti qwk per EPO e q2wk per DARB (entrambi 46,0%;
  5. I modelli di utilizzo dell’ESA in pazienti adulti ambulatoriali con malattia renale cronica presso questa struttura hanno indicato che i medici hanno esteso gli intervalli di somministrazione oltre quelli indicati nelle informazioni sulla prescrizione approvate. Tuttavia, durante la terapia di mantenimento somministrata a intervalli di dose estesi, si sono verificate differenze nei livelli di Hb, portando alla ripresa di intervalli di dose più brevi nella maggior parte dei pazienti.
Un’analisi comparativa dei fattori di rischio metabolico per la progressione della steatosi epatica non alcolica
La steatosi epatica non alcolica (NAFLD), la malattia epatica cronica dominante al mondo, copre lo spettro di malattie che vanno dalla steatosi lieve all’epatite grassa che causa fibrosi senza un consumo significativo di alcol. I principali fattori di rischio (RF) includono obesità, diabete di tipo 2 e dislipidemia. Attualmente, non esiste una gerarchia stabilita degli effetti delle RF metaboliche sulla progressione della NAFLD. In questo studio di coorte retrospettivo, sono stati esaminati e classificati gli effetti indipendenti e cumulativi dei tre principali RF sulla progressione della NAFLD.
652 pazienti NAFLD con ≥ 1 RF sono stati classificati in base alla RF combinata per studiare i cambiamenti annuali nella gravità della RF con la misurazione della rigidità epatica (LSM) nell’arco di cinque anni. Sono stati discussi l’indice di massa corporea (BMI), l’   emoglicina  A1c   (HbA1c  )  , il colesterolo totale (TC) e l’LSM .
Nei pazienti con un singolo miglioramento della RF, le diminuzioni del BMI erano associate a una variazione annuale dell’LSM di -1,26 kPa, mentre le diminuzioni di HbA1c    e TC erano associate a una variazione rispettivamente di -0,51 kPa e -0,56 kPa Nei pazienti con un singolo peggioramento della RF, un aumento del BMI era correlato a una variazione dell’LSM di +0,74 kPa e aumenti di HbA1c    e TC erano correlati a una variazione rispettivamente di  +0,43   kPa e +0,16 kPa .

L’acetilcolina è un neurotrasmettitore essenziale che si trova in tutto il sistema nervoso. 

  1. La sua azione sui recettori postsinaptici è regolata dall’idrolisi da parte di varie carbossilesterasi, in particolare colinesterasi (ChEs). La tossicità acuta dei composti organofosforici (OP) è direttamente correlata alla loro attività come inibitori del ChE. Un test ampiamente utilizzato per valutare l’attività ChE è il metodo spettrofotometrico sviluppato da Ellman et al. Quando la fonte dell’enzima è derivata dai tessuti o, in particolare, dal sangue, l’emoglobina mostra un picco spettrofotometrico alla stessa lunghezza d’onda utilizzata per l’analisi dell’attività colinergica.
  2. Ciò crea uno sfondo significativo che interferisce con il test di Ellman e deve essere superato per monitorare da vicino l’attività della colinesterasi. Qui confrontiamo direttamente i metodi di elaborazione del sangue: il metodo classico (1,67 ± 0,30 U / ml) e  il metodo HemogloBind  (1,51 ± 0,17 U / ml) e mostriamo chiaramente che il pretrattamento dei campioni di sangue con  emoglobina   è sia sufficiente che sufficiente. e un metodo rapido di preparazione del campione per la valutazione dell’attività ChE mediante il metodo Ellman.

Metodologia innovativa per l’analisi dei sottoproteomi di membrana e degli eritrociti citosolici mediante il metodo 2-DE.

  • Al fine di testare un’ampia coorte di campioni di eritrociti in un contesto clinico, proponiamo un nuovo approccio che consente l’analisi sia del citosolico umano che dei subproteomi di membrana.
  • Nonostante la sua struttura semplice, l’alto contenuto di emoglobina presente nei globuli rossi (RBC) rende estremamente difficile l’analisi del proteoma. Qui indaghiamo diverse strategie per isolare la membrana e le frazioni citosoliche dagli eritrociti e il loro effetto sulla profilazione del proteoma da parte di 2-DE, prestando particolare attenzione alla rimozione dell’emoglobina.
  • Un approccio semplice, veloce e soddisfacente all’esaurimento dell’emoglobina basato sul  reagente HemogloBind   è stato applicato con successo alle cellule eritrocitarie, rendendo possibile l’analisi del sottoproteoma citosolico con 2-DE senza troppe interferenze.
  • Per il proteoma di membrana, qui viene descritta una nuova strategia combinata basata sull’isolamento mediante lisi ipotonica e ulteriore purificazione su minicolonne, che consente il rilevamento di proteine ​​​​ad alto peso molecolare (cioè spettrina, ankyrin) e modelli 2-DE ben separati.

Dissociation Reagent, 5ML

X017-5ML Arbor Assays 5ML 122 EUR

Stop Solution, 5ML

X020-5ML Arbor Assays 5ML 65 EUR

Dry DMSO, 5ML

X022-5ML Arbor Assays 5ML 122 EUR

Borohydride Buffer, 5ML

X027-5ML Arbor Assays 5ML 122 EUR

NADPH Diluent, 5ML

X034-5ML Arbor Assays 5ML 87 EUR

Dissociation Reagent, 5ML

X058-5ML Arbor Assays 5ML 109 EUR

Stop Solution, 5ML

X134-5ML Arbor Assays 5ML 65 EUR

Hydrogen Peroxide Reagent, 5ML

C115-5ML Arbor Assays 5ML 123 EUR

Fluorescent Detection Reagent, 5ML

C116-5ML Arbor Assays 5ML 268 EUR

Hydrogen Peroxide Reagent, 5ML

C132-5ML Arbor Assays 5 ML 123 EUR

Color Reagent A, 5ML

X092-5ML Arbor Assays 5ML 109 EUR

Color Reagent B, 5ML

X093-5ML Arbor Assays 5ML 109 EUR

DetectX® Formaldehyde Reagent, 5ML

C002-5ML Arbor Assays 5ML 478 EUR

DetectX® RBP Conjugate, 5ML

C010-5ML Arbor Assays 5ML 237 EUR

DetectX® Osteopontin Conjugate, 5ML

C125-5ML Arbor Assays 5ML 237 EUR

DetectX® Prolactin Conjugate, 5ML

C138-5ML Arbor Assays 5ML 178 EUR

DetectX® Insulin Conjugate, 5ML

C186-5ML Arbor Assays 5ML 268 EUR

5ML SELF STANDING SCREW-CAP TUBE,

ST-5ML CORNING 500/pk 199 EUR

DetectX® Cystatin C Conjugate, 5ML

C034-5ML Arbor Assays 5ML 237 EUR

DetectX® Endothelin-1 Conjugated Antibody, 5ML

C159-5ML Arbor Assays 5ML 237 EUR

5ML SELF STANDING SCREW-CAP TUBE WITH BLUE CAP, UNASSEMBLED

SCT-5ML CORNING 500/pk 118 EUR

HemogloBind™

H0145-05 Biotech Support Group 5 mL 359 EUR

HemogloBind™

H0145-15 Biotech Support Group 15 mL 709 EUR

HemogloBind™

H0145-50 Biotech Support Group 50 mL 1420 EUR

SingleStep Poly-HRP Anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-5ml

Q2AB1-5ml EnQuireBio 5ml 131 EUR

SingleStep Poly-HRP Anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP-5ml

Q2AB2-5ml EnQuireBio 5ml 131 EUR

5ML SELF STANDING SCREW-CAP TUBE WITH BLUE CAP, UNASSEMBLED, PRE-STERILIZED

SCT-5ML-S CORNING 25/pk 126 EUR

HemogloBind™ Trial Kit

HB145K-05 Biotech Support Group 420 EUR

HemogloBind™ Nucleic Acid

HN250-20 Biotech Support Group 20 preps 364 EUR

HemogloBind™ Nucleic Acid

HN250-200 Biotech Support Group 200 preps 1014 EUR

NuGel-HemogloBind™ (Hemoglobin Removal) Kit

NP-HO-T25 Biotech Support Group 25 preps 643 EUR

NuGel-HemogloBind™ (Hemoglobin Removal) Kit

NP-HO-T50 Biotech Support Group 50 preps 1176 EUR

HemogloBind™ Blood Card Reagent Kit

H0145BC-10 Biotech Support Group 10 preps 450 EUR

HemogloBind™ Blood Card Reagent Kit

H0145BC-50 Biotech Support Group 50 preps 1623 EUR

Tube Holder for 5ml tubes (2 x 5ml)

D1036-A5 Benchmark Scientific 1 PC 158.09 EUR

5ml Tube holder

D2400-R5 Benchmark Scientific 1 PC 742.73 EUR

5ml Pipette Tips

P7700-T5M Benchmark Scientific 1 PC 81.68 EUR

COOLRACK XT 5ML HOLDS 12 X 5ML CENTRIFUGE TUBES

432060 CORNING 1/pk 297 EUR

Rabbit Complement UnadsoRabbited 5mL

31060-2 Pel-Freez 5mL 83.49 EUR

Rabbit Complement ADSORabbitED 5mL

31063-2 Pel-Freez 5mL 119.38 EUR

7077B PIPET SHRTY 5ML

7077B-5 CORNING 200/pk 397 EUR

7078B PIPET SHRTY 5ML

7078B-5 CORNING 200/pk 380 EUR

CORNING, SYRINGE TIPS, 5ML

6624 CORNING 1/pk 77 EUR

Fc Receptor Blocker, 5ml

NB309-5S Innovex 5 ml 188 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, sterile, ten bags of 20 tubes

C2520 MTC Bio 200/pack 80.38 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, non-sterile, 4 bags of 50 tubes

C2500 MTC Bio 200/pack 76.66 EUR

1-5ML SINGLE CHANNEL PIPETTOR

AP-5000 CORNING 1/pk 200 EUR

CORNING, SYRINGE TIPS, 5ML, STERILE

6632 CORNING 1/pk 101 EUR

Sterile 5mL Transport Tube (Axygen)

TUBE5AX-S2 Next Advance 500box 223 EUR

Sterile 5mL Centrifuge Tube (Eppendorf)

TUBE5EP-S Next Advance 200box 155 EUR

5mL MacroTube Starter Kit. Includes

C2500-SK MTC Bio 1/pack 183.65 EUR

Block for 5ml centrifuge tubes

H5000-5MT Benchmark Scientific 1 PC 382.55 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, non-sterile, 4 bags of 50 tubes, assorted colors

C2500-AST MTC Bio 200/pack 76.66 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, non-sterile, 4 bags of 50 tubes, blue tinted

C2500-B MTC Bio 200/pack 76.66 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, non-sterile, 4 bags of 50 tubes, green tinted

C2500-G MTC Bio 200/pack 76.66 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, non-sterile, 4 bags of 50 tubes, red tinted

C2500-R MTC Bio 200/pack 76.66 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, non-sterile, 4 bags of 50 tubes, yellow tinted

C2500-Y MTC Bio 200/pack 76.66 EUR

Human Serum IgG Depl Pooled (5mL)

34021-5 Pel-Freez 5mL 130.25 EUR

7077 5 PIPET 5ML STERILE STERILE

7077-5N CORNING 120/pk 248 EUR

7078 5 PIPET 5ML STERILE STERILE

7078-5N CORNING 240/pk 282 EUR

7078D 5 PIPET 5ML STERILE STERILE

7078D-5 CORNING 25/pk 217 EUR

CENT TUBE,DISP,SCREW CAP,5ML

99502-5 CORNING 125/pk 97 EUR

5ML PIPET TIPS COMPATIBLE WITH GILSON

T-5000-C CORNING 250/pk 161 EUR

Non-Sterile 5mL Transport Tube (Axygen)

TUBE5AX Next Advance 1000box 214 EUR

Serological Pipettes, 5ml, 400 per case

SP102116 Bio Basic 1CS, 400UNIT 179.94 EUR

Serological Pipettes, 5ml , Sterile, Individually Wrapped

LC3063-200 GenDepot 200/pk 111 EUR

5mL Snap-Cap MacroTube, 5ml, non-sterile, 4 bags of 50 tubes, opaque black tint

C2500-OB MTC Bio 200/pack 76.66 EUR

Human Comp IgG/IgM Depleted Pooled (5mL)

34010-5 Pel-Freez 5mL 255.31 EUR

Human Serum IgG/IgM Depl Pooled (5mL)

34014-5 Pel-Freez 5mL 152 EUR

CORNING® PURAMATRIX™ PEPTIDE HYDROGEL, 5ML

354250 CORNING 1/pk 285 EUR

PIPETTE,5ML,PS,S,BK,50BAG/500

4050 CORNING 50/pk 151 EUR

5ml Tube, Dual Cap, Polypropylene, 100/Bag

TD535 Bio Basic 1PK, 100UNIT 56.09 EUR

Tips, 5ml for Propette and Propette LE

P4305 MTC Bio 250/pack 82.4 EUR

Human Lipoprotein (a) Calibrator 3 Protein

abx060886-5ml Abbexa 5 ml 342 EUR

SDS-PAGE Sample Loading Buffer (2x)

abx090647-5ml Abbexa 5 ml 175 EUR

SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5x)

abx090648-5ml Abbexa 5 ml 189 EUR

SDS-PAGE Sample Loading Buffer (6x)

abx090649-5ml Abbexa 5 ml 203 EUR

Native Gel Sample Loading Buffer (2x)

abx090650-5ml Abbexa 5 ml 175 EUR

Native Gel Sample Loading Buffer (5x)

abx090651-5ml Abbexa 5 ml 189 EUR

Protein A Resin

abx098111-5ml Abbexa 5 ml 398 EUR

Protein G Resin

abx098112-5ml Abbexa 5 ml 439 EUR

6x Protein Loading Buffer

abx098124-5ml Abbexa 5 ml 189 EUR

G418

abx098131-5ml Abbexa 5 ml 217 EUR

DNA Loading Buffer

abx098143-5ml Abbexa 5 ml 175 EUR

Library Dilution Buffer

abx098898-5ml Abbexa 5 ml 258 EUR

Synaptopodin (SYNPO) Antibody

abx020657-5ml Abbexa 5 ml 996 EUR

Lamin (Mixed) Antibody

abx020891-5ml Abbexa 5 ml 592 EUR

Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) Antibody

abx022049-5ml Abbexa 5 ml 676 EUR

Desmocollin 3 (DSC3) Antibody

abx022465-5ml Abbexa 5 ml 968 EUR

MHC Class II I-Ab Antibody

abx412635-5ml Abbexa 5 ml 606 EUR

Cytokeratin 18 / CK-18 (KRT18) Antibody

abx413457-5ml Abbexa 5 ml 606 EUR

Epithelial Cell Adhesion Molecule (CD326) Antibody

abx415574-5ml Abbexa 5 ml 606 EUR

C to C Lysis Buffer

abx298007-5ml Abbexa 5 ml 286 EUR

CDM-XF Supplement

abx298010-5ml Abbexa 5 ml 286 EUR

Eugenol

GK9909-5ML Glentham Life Sciences 5 ml 42 EUR

Linolenic acid

GL9596-5ML Glentham Life Sciences 5 ml 54 EUR
  • Un’aliquota della frazione di membrana è stata anche digerita in soluzione e analizzata mediante nano-LC accoppiato a uno spettrometro di massa LTQ-Orbitrap. Con questo approccio, sono state identificate un totale di 188 proteine ​​uniche. Questo studio costituisce la base per futuri studi clinici in cui potrebbero essere coinvolti i globuli rossi.

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