Luglio 2, 2022

Metodi per il monitoraggio dei sottoproteomi funzionali degli inibitori della proteasi SERPIN

L’arricchimento del proteoma a base di perline migliora le proprietà della piastra di eluizione proteica (PEP) per il profilo proteomico funzionale. Una nuova tecnologia di proteomica funzionale chiamata PEP (Protein Elution Plate) è stata sviluppata per separare i proteomi complessi dalle fonti naturali e analizzare sistematicamente la funzione delle proteine. La tecnologia utilizza l’alta risoluzione dell’elettroforesi su gel bidimensionale (gel 2-D). La modifica delle condizioni elettroforetiche in combinazione con la piastra di eluizione proteica ad alta risoluzione aiuta il recupero di proteine ​​funzionalmente attive. 

  1. Poiché la risoluzione di 2DE (elettroforesi bidimensionale) può essere limitata dal carico proteico, abbiamo studiato l’uso di tecnologie di arricchimento basate su perline chiamate  AlbuVoid  e KinaSorb per determinare il loro effetto sulle caratteristiche proteomiche che possono essere generate dalla piattaforma PEP.
  2. Utilizzando una varietà di substrati e test di attività enzimatica, annunciamo i vantaggi di una combinazione di arricchimento a base di perline per migliorare il rapporto del segnale e i tratti generati per l’attività di esochinasi, protein chinasi, proteasi e fosfatasi alcalina. 
  3. Di conseguenza, la tecnologia PEP consente l’analisi sistematica di grandi famiglie di enzimi e può costruire un quadro completo della funzione delle proteine ​​dal complesso proteoma, fornendo informazioni biologiche che altrimenti non sarebbero osservate se si analizzasse solo l’abbondanza di proteine.

Ferroptosi: forma ferro-dipendente di morte cellulare non apoptotica.

Identifichiamo la piccola molecola di ferrostatina-1 come un potente inibitore della ferroptosi nelle cellule tumorali e della morte cellulare indotta dal glutammato nelle sezioni organotipiche del cervello di ratto, suggerendo somiglianze tra i due processi. Infatti, l’erastina, come il glutammato, inibisce l’assorbimento della cistina da parte del sistema antiporta cistina/glutammato (x (c) (-)), creando un   vuoto   nella difesa antiossidante della cellula e portando infine alla morte ossidativa ferro-dipendente. Pertanto, l’attivazione della ferroptosi provoca la distruzione non apoptotica di alcune cellule tumorali, mentre l’inibizione di questo processo può proteggere gli organismi dalla neurodegenerazione.

Genesi e influenza funzionale della variazione del numero di copie nel genoma umano.

  • Le varianti strutturali del DNA superiori a 1 kilobase rappresentano la maggior parte delle basi che differiscono nei genomi umani ma sono ancora relativamente sottostimate. Qui utilizziamo microarray di oligonucleotidi piastrellati di 42 milioni di sonde per generare una mappa completa di 11.700 modifiche del numero di copie (CNV) maggiori di 443 coppie di basi, la maggior parte delle quali (8.599) sono state verificate in modo indipendente. Per 4978 di questi CNV, abbiamo generato genotipi di riferimento da 450 individui di origine europea, africana o dell’Asia orientale.
  • I meccanismi di mutazione dominante differiscono a seconda delle classi dimensionali del CNV. La retrotrasposizione ha portato alla duplicazione e all’inserimento di diversi segmenti di DNA codificanti e non codificanti in modo casuale attorno al genoma. Inoltre, correlando con noti polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) correlati ai tratti, abbiamo identificato 30 loci CNV che sono candidati per influenzare la suscettibilità alle malattie.
  • Anche così, dopo aver valutato la completezza della nostra mappa e i modelli di squilibrio di feedback tra CNV e SNP, concludiamo che, nel caso di tratti complessi, il   vuoto di ereditarietà  lasciato dagli studi di associazione dell’ampio genoma non sarà spiegato da CNV comuni.

Porosità di scaffold in biomateriali 3D e osteogenesi.

  1. La porosità e la dimensione dei pori degli scaffold di biomateriali svolgono un ruolo chiave nella formazione ossea in vitro e in vivo. Questa recensione esamina lo stato dell’arte sulla relazione tra porosità e dimensione dei pori nei biomateriali utilizzati per la rigenerazione ossea.
  2. Vengono discusse l’influenza di queste caratteristiche morfologiche sull’osteogenesi in vitro e in vivo, nonché le relazioni con le proprietà meccaniche degli scaffold.
  3. In vitro, la minore porosità stimola l’osteogenesi inibendo la proliferazione cellulare e forzando l’aggregazione cellulare. Al contrario,  una maggiore porosità e dimensioni dei pori in vivo determinano una maggiore crescita ossea, confermando la mancanza di segnalazioni che mostrano migliori risultati osteogenici per scaffold con basso  volume di vuoto.
  4. Tuttavia, questa tendenza provoca il deterioramento delle proprietà meccaniche, ponendo così un limite funzionale superiore alla dimensione dei pori e alla porosità. Pertanto, è necessario trovare un equilibrio a seconda della riparazione, del tasso di ricostruzione e del tasso di degrado del materiale dell’impalcatura. Sulla base delle prime ricerche, si ritiene che il requisito minimo di dimensione dei pori sia di circa 100 micrometri a causa delle dimensioni delle cellule, della migrazione e dei requisiti di trasporto.
  5. Tuttavia, si raccomandano dimensioni dei pori > 300 micrometri a causa della maggiore formazione di nuovo osso e di capillari. A causa della vascolarizzazione, è stato dimostrato che la dimensione dei pori influenza la progressione dell’osteogenesi. I piccoli pori promuovono l’ipossia e inducono la formazione dell’osso cartilagineo prima dell’osteogenesi, mentre i pori dilatati che sono ben vascolarizzati portano all’osteogenesi diretta (senza una precedente formazione della cartilagine).
  6. I gradienti delle dimensioni dei pori sono consigliati per ricerche future incentrate sulla formazione di più tessuti e interfacce tissutali.
    • Le varianti conformazionali di una famiglia unica di inibitori della proteasi, denominate SERPIN, sono molto spesso sottorappresentate nelle analisi proteomiche. Ciò limita la comprensione della complessa regolazione che questa famiglia di proteine ​​presenta alle reti nelle reti di interazione della proteasi.
    • Utilizzando la separazione a base di perline fornita dalla famiglia di prodotti di arricchimento proteomico, in particolare   AlbuVoid  ™ e AlbuSorb, dimostriamo la loro utilità nella ricerca sul siero SERPIN  . Suggeriamo inoltre di utilizzarli per sviluppare profili funzionali delle proteoforme SERPIN e come possono stabilire associazioni con fenotipi di malattie, mutazioni geniche e meccanismi deregolati.

    Identificazione di biomarcatori metabolici funzionali dal siero di un paziente con cancro del polmone utilizzando la tecnologia PEP

    Il metabolismo sovraprogrammato è il nuovo segno distintivo del cancro. In molti tipi di cancro, la maggior parte dei geni nella via glicolitica sono sovraespressi, riflettendo un cambiamento significativo nel metabolismo durante lo sviluppo del cancro. Il metabolismo sovraprogrammato contribuisce allo sviluppo del cancro in molti modi, dalla fornitura di un maggiore fabbisogno energetico alla creazione di un microambiente adatto alla crescita del tumore e alla soppressione del sistema di sorveglianza immunitaria umana.

    1. Questo studio ha utilizzato un approccio proteomico funzionale top-down per monitorare sistematicamente l’attività degli enzimi metabolici nelle proteine ​​sieriche disciolte prodotte da una separazione di gel 2-D modificata seguita da una piastra di washout delle proteine, un metodo noto collettivamente come PEP.
    2. Abbiamo scoperto che l’arricchimento di proteine ​​a bassa abbondanza con un prodotto a base di perline chiamato   AlbuVoid  (,) è importante per aumentare il numero di caratteristiche osservabili e aumentare il livello di segnale ottenibile dal test utilizzato.
    3. I nostri metodi  hanno rilevato attività significative degli enzimi metabolici nei sieri di pazienti sani e con cancro del polmone in più frazioni dopo l’eluizione delle proteine ​​separate su un gel 2-D per l’eluizione delle proteine
    4. Piatto (PEP). Diciotto frazioni con la differenza più drammatica nell’attività enzimatica metabolica tra il siero normale e quella dei pazienti con cancro del polmone sono state sottoposte all’identificazione delle proteine ​​mediante spettrometria di massa. Proteine ​​della via metabolica glicolitica, come
    5. GAPDH è stato identificato insieme ad altre proteine ​​non precedentemente assegnate alla via glicolitica. Un’ulteriore verifica con GAPDH commercialmente purificato ha mostrato che l’aggiunta del GAPDH purificato al sistema di test enzimatico metabolico utilizzato ha aumentato l’attività enzimatica, dimostrando che le proteine ​​identificate dalla tecnologia PEP e dalla spettrometria di massa potrebbero essere ulteriormente verificate con un test biologico.

     

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    Questo studio ha identificato diversi potenziali biomarcatori enzimatici funzionali dal siero di pazienti affetti da cancro del polmone, fornendo un approccio alternativo e complementare all’assegnazione di sequenze per la scoperta di biomarcatori nelle malattie umane.

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