Miglioramento dei metodi di coltura cellulare per la generazione di successo di colture cellulari primarie di cheratinociti umani utilizzando vettori lipidici nanostrutturati caricati con EGF

Le colture primarie di cheratinociti della pelle umana possono essere stabilite da biopsie cutanee con terreni di coltura contenenti fattore di crescita epiteliale (EGF). Sebbene i metodi attuali siano efficienti, è necessaria l’ottimizzazione per accelerare la procedura e ottenere queste colture in meno tempo. Nel presente studio, abbiamo valutato l’effetto di nuove formulazioni basate su vettori lipidici nanostrutturati (NLC) caricati con EGF. In primo luogo, la biosicurezza di NLC contenente EGF umano ricombinante (NLC-rhEGF) è stata verificata nei cheratinociti della pelle immortalizzati e nelle cellule epiteliali della cornea e in due linee cellulari di cancro epiteliale, quantificando il DNA libero rilasciato nel terreno di coltura.

Quindi abbiamo stabilito colture cellulari primarie di cheratinociti della pelle umana con terreni di coltura basali (BM) e BM integrati con NLC-rhEGF, EGF liquido (L-rhEGF) o NLC da solo (NLC-blank). I risultati hanno mostrato che le cellule isolate mediante digestione enzimatica e coltivate con o senza uno strato di alimentazione avevano un tasso di crescita simile indipendentemente dal mezzo utilizzato. Tuttavia, la tecnica di espianto ha mostrato una maggiore efficienza quando è stato utilizzato il terreno di coltura NLC-rhEGF, rispetto a BM, L-rhEGF o NLC-blank.

L’analisi dell’espressione genica ha mostrato che NLC-rhEGF era in grado di aumentare l’espressione genica EGFR , insieme a quella di altri geni correlati alle citocheratine, alle giunzioni cellula-cellula e alla maturazione e differenziazione dei cheratinociti. In sintesi, questi risultati supportano l’uso di NLC-rhEGF per migliorare l’efficienza dei metodi basati sull’espianto nella generazione efficiente di colture cellulari primarie di cheratinociti umani per l’ingegneria dei tessuti.

Co-coltura di cellule endoteliali del legamento parodontale umano e della vena ombelicale per la prevascolarizzazione degli scaffold per l’ingegneria dei tessuti angiogenici e osteogenici

(1) Contesto: la vascolarizzazione rimane una sfida critica nell’ingegneria del tessuto osseo. L’obiettivo di questo studio era di prevascolarizzare lo scaffold di cemento fosfato di calcio (CPC) mediante la co-coltura di cellule staminali del legamento parodontale umano (hPDLSC) e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (hUVEC) per la prima volta;

(2) Metodi: hPDLSC e/o hUVEC sono stati seminati su scaffold CPC. Sono stati testati tre gruppi: (i) gruppo hUVEC (hUVEC su CPC); (ii) gruppo hPDLSC (hPDLSC su CPC); (iii) gruppo di co-coltura (hPDLSC + hUVEC su CPC). Sono state valutate la differenziazione osteogenica, la sintesi minerale ossea e le strutture microcapillari; (3) Risultati: le espressioni geniche angiogeniche del gruppo di co-coltura erano 6-9 volte quelle della monocoltura.

L’espressione di vWF del gruppo di co-coltura era 3 volte inferiore rispetto al gruppo di hUVEC-monocoltura. Le espressioni osteogeniche del gruppo di co-coltura erano 2-3 volte quelle del gruppo di hPDLSC-monocoltura. L’attività dell’ALP e la sintesi minerale ossea della co-coltura erano molto più elevate rispetto al gruppo hPDLSC-monocoltura.

Il gruppo di co-coltura ha formato strutture simili a capillari a 14-21 giorni. La lunghezza delle navi e il numero degli incroci aumentarono con il tempo; (4) Conclusioni: La co-coltura hUVEC + hPDLSC su scaffold CPC ha raggiunto per la prima volta in vitro un’eccellente capacità osteogenica e angiogenica, generando reti prevascolarizzate. La co-coltura hPDLSC + hUVEC ha avuto un’osteogenesi e un’angiogenesi molto migliori rispetto alla monocoltura. Gli scaffold CPC prevacolarizzati tramite hPDLSC + hUVEC sono promettenti per applicazioni dentali, craniofacciali e ortopediche.

Sviluppo del processo per vaccini con vettore di virus della malattia di Newcastle in colture in sospensione di cellule Vero senza siero

L’attuale pandemia di COVID-19 ha attirato l’attenzione globale sulle malattie infettive, attirando numerose risorse per lo sviluppo di piani di preparazione alla pandemia e piattaforme-tecnologie di vaccini con solidi processi di produzione che possono essere rapidamente orientati per colpire le malattie emergenti. Il virus della malattia di Newcastle (NDV) è stato studiato come vettore virale per vaccini umani e veterinari, ma la sua produzione si basa molto su uova di gallina embrionate, con pochissimi studi che producono NDV in coltura cellulare.

Qui, NDV viene prodotto in sospensione di cellule Vero e vengono sviluppati saggi analitici (TCID ₅₀ e ddPCR) per quantificare il titolo virale infettivo e totale. NDV-GFP e NDV-FLS (SARS-CoV-2 a tutta lunghezza costrutti proteici picco sono stati adattati per replicare in Vero e HEK293 colture in sospensione utilizzando mezzo privo di siero, mentre i parametri di regolazione puntuale come MOI, temperatura e concentrazione tripsina. La produzione di flaconi di agitazione con cellule Vero ha prodotto titoli infettivi di 1,07 × 10 ⁸ TCID ₅₀ / ml per NDV-GFP e 1,33 × 10 ⁸ TCID ₅₀ / ml per NDV-FLS.

La produzione in bioreattori batch da 1 L ha portato anche a titoli elevati nei surnatanti di coltura, raggiungendo 2,37 × 10 ⁸ TCID ₅₀ / mL per NDV-GFP e 3,16 × 10 ⁷ TCID ₅₀ / ml per NDV-FLS. Ciò mostra un’efficace produzione di NDV nella coltura cellulare, creando le basi per un processo di produzione di vaccini vettoriali scalabile che può essere applicato a diversi bersagli.

Un vaccino per l’encefalite giapponese derivato da colture cellulari inattivate e adiuvato da Advax induce anticorpi anti-Flavivirus ampiamente neutralizzanti, una solida immunità cellulare e fornisce protezione dalla dose singola

ccJE + Advax è un vaccino per l’encefalite giapponese (JE) in coltura cellulare inattivato formulato con Advax, un nuovo adiuvante polisaccaridico a base di delta inulina. Questo vaccino ha già mostrato risultati promettenti negli studi sui topi e sugli equini e l’attuale studio ha cercato di comprendere meglio il suo meccanismo d’azione e valutare la fattibilità della protezione del vaccino a dose singola. I topi immunizzati con ccJE + Advax avevano titoli di neutralizzazione del siero più elevati rispetto a quelli immunizzati con solo ccJE o con adiuvante allume.

ccJE + Advax ha indotto anticorpi di neutralizzazione incrociata straordinariamente ampi contro più flavivirus tra cui il virus del Nilo occidentale (WNV), il virus dell’encefalite della Murray Valley (MVEV), il virus dell’encefalite di St Louis (SLEV) e il virus della dengue-1 e -2 (DENV-1 e – 2). In particolare, gli anticorpi cross-neutralizzanti DENV-2 da topi immunizzati ccJE + Advax non avevano in modo univoco attività di potenziamento dell’infezione dipendente dall’anticorpo DENV-2 (ADIE), in contrasto con l’elevata attività ADIE osservata con gli anticorpi cross-reattivi DENV-1 indotti da mbJE o ccJE da solo o con adiuvante allume. Gli splenociti stimolati da JEV da topi immunizzati con ccJE + Advax hanno mostrato un aumento della produzione di IL-17 e IFN-γ, coerente con una risposta mista Th1 e Th17, mentre ccJE-allume era associato alla produzione principalmente di citochine Th2.

In uno studio di provocazione letale nel topo contro il ceppo JaTH160 JEV altamente virulento, ccJE + Advax ha conferito una protezione completa in una schedula a due dosi con 50 ng di antigene vaccinale e una protezione quasi completa dopo una singola dose di 200 ng di antigene vaccinale. C’è una continua mancanza di vaccini umani contro particolari flavivirus, inclusi WNV, SLEV e MVEV. Data la sua capacità di fornire protezione JEV a dose singola e indurre anticorpi ampiamente neutralizzanti privi di attività ADIE, il vaccino ccJE + Advax potrebbe essere utile in situazioni in cui è desiderabile una protezione rapida, ad esempio durante un’epidemia locale o per l’uso in viaggiatori o eserciti che richiedono una rapida dispiegamento nelle regioni endemiche JEV.