Dipendenza metabolica della deformabilità dei globuli rossi

• L’enorme complessità, l’ampia gamma dinamica delle abbondanze relative delle proteine ​​di interesse (oltre 10 ordini di grandezza) e l’enorme eterogeneità  (dovuta a modificazioni post-traduzionali come la glicosilazione) del proteoma plasmatico umano minano gravemente le metodologie analitiche esistenti.
• Qui descriviamo un approccio per analizzare ampiamente le N-  glicoproteine ​​del plasma umano  utilizzando una combinazione di sottrazione dell’affinità immunitaria e  cattura della glicoproteina   per ridurre sia l’intervallo di concentrazione delle proteine ​​che la complessità complessiva del campione.
• Sei proteine ​​plasmatiche ad alta abbondanza sono state rimosse simultaneamente utilizzando una colonna preconfezionata di anticorpi immobilizzati. Le glicoproteine ​​N-linked sono state quindi  catturate dal plasma impoverito utilizzando una resina idrazide e digerite enzimaticamente, e gli N-glicopeptidi legati sono stati rilasciati utilizzando la peptide-N-glicosidasi F (PNGasi F).
• Dopo un elevato frazionamento di scambio cationico (SCX), i peptidi deglicosilati sono stati analizzati mediante cromatografia liquida capillare a fase inversa combinata con spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS).
• Utilizzando criteri rigorosi, sono stati sicuramente identificati 2053 diversi N-glicopeptidi, comprese 303 N-  glicoproteine ​​non ridondanti  .
• Questa strategia  di arricchimento   ha migliorato significativamente la rilevazione e ha permesso l’identificazione di un certo numero di proteine ​​a bassa abbondanza, come la proteina antagonista del recettore dell’interleuchina-1 (circa 200 pg/ml), la catepsina L (circa 1 ng/ml) e il fattore di crescita trasformante beta 1 (circa 2 ng/ml).
• Sono stati identificati un totale di 639 siti di N-glicosilazione e inizialmente hanno dimostrato l’elevata precisione complessiva di queste assegnazioni del sito di glicosilazione, valutata mediante un’accurata misurazione della massa utilizzando la cromatografia liquida ad alta risoluzione accoppiata alla spettrometria di massa della risonanza ciclotronica ionica a trasformata di Fourier (LC-FTICR).

È stato studiato il contributo dello stato metabolico degli eritrociti umani al mantenimento della deformabilità cellulare durante e dopo l’incubazione del siero in vitro fino a 28 ore.

•  La perdita iniziale di deformabilità della membrana è diventata evidente tra 4 e 6 ore quando i livelli cellulari  di adenosina trifosfato  (ATP) erano circa il 70% dei valori iniziali. La deformabilità del film è poi rimasta stabile tra le 6 e le 10 ore.
• Dopo 10 ore, quando l’ATP cellulare era sceso a <15% del valore basale, i cambiamenti paralleli progressivi del calcio dei globuli rossi aumentavano del 400% entro 24 ore. e nella viscosità della sospensione di globuli rossi, che è aumentata del 500-750% dopo 24 ore. .
• C’era anche un’ulteriore progressiva diminuzione della deformabilità della membrana, come riflesso in un aumento del 1000% della pressione negativa richiesta per deformare la membrana.
• La filtrabilità dei globuli rossi è scesa a zero quando si è verificata una trasformazione da disco a sfera. Questi cambiamenti sono stati accompagnati da un aumento della quantità di emoglobina residua e di proteine ​​non emoglobiniche. La rigenerazione dell’ATP nelle cellule esaurite mediante incubazione con adenosina ha comportato un’inversione significativa di questi cambiamenti, anche in presenza di ouabain.
• L’incorporazione di calcio nelle ombre ricostituite preparate da globuli rossi freschi imitava lo stato di esaurimento e l’incorporazione di ATP, etilendiamminotetraacetato (EDTA) e magnesio nelle cellule esaurite imitava l’effetto dell’adenosina nelle cellule impoverite intatte. L’ATP aggiunto esternamente alle cellule esaurite entro 24 ore non ha avuto alcun effetto.
• L’introduzione simultanea di EDTA, ATP o magnesio insieme al calcio nelle ombre ricostruite ha impedito una marcata riduzione della deformabilità causata dal solo calcio. Incorporazione di adenosina difosfato (ADP), nicotinamide adenina dinucleotide (NAD), NAD fosfato (NADP), NADP, forma ridotta (NADPH), glutatione, forma ridotta (GSH),   inosina trifosfato  (ITP),   guanosina trifosfato  (GTP) e   trifosfato    ( GTP
• Questi dati suggeriscono che il ruolo principale dell’ATP nel mantenimento della vitalità dei globuli rossi è correlato alla conservazione della deformabilità della membrana dei globuli rossi. 

• Si suggerisce che i cambiamenti osservati nelle proprietà fisiche degli eritrociti impoveriti di ATP rappresentino cambiamenti sol-gel dipendenti dall’ATP-calcio all’interfaccia tra la membrana e l’interno della cellula e che l’equilibrio sol-gel determini la deformabilità della membrana.