Gennaio 31, 2023

Epilettogenesi sperimentale in un modello di coltura cellulare di neuroni primari da cervello di ratto: uno studio multiscala temporale

Comprendere lo sviluppo delle crisi richiede una conoscenza integrata delle diverse scale di organizzazione delle reti epilettiche. Abbiamo sviluppato un modello di “epilessia nel piatto” basato su cellule neuronali primarie dissociate dall’ippocampo neonatale di ratto. Dimostriamo come una singola applicazione di glutammato ha stimolato i neuroni a generare attività di picco sincrona spontanea con un’ulteriore progressione in eventi spontanei simili a crisi dopo un periodo di latenza distinto.

Mediante analisi computazionale, abbiamo confrontato l’attività neuronale osservata in vitro con i dati dell’elettroencefalografia intracranica (EEG) registrati da pazienti con epilessia e abbiamo identificato forti somiglianze, inclusa una sequenza correlata di eventi con inizio, progressione e termine definiti.

Successivamente, è stato stabilito un collegamento tra i cambiamenti neurofisiologici con la composizione della rete e la struttura cellulare fino ai cambiamenti molecolari. Lo sviluppo temporale dell’attività della rete epilettiforme è correlato con una maggiore crescita dei neuriti e ramificazione alterata, aumento del rapporto tra sinapsi glutamatergiche su GABAergiche e perdita di interneuroni calbindina-positivi, nonché alterazioni dell’intero genoma nella metilazione del DNA.

I geni differenzialmente metilati erano coinvolti in varie attività cellulari legate alla struttura cellulare, alla segnalazione intracellulare e alla regolazione dell’espressione genica. I nostri dati forniscono la prova che un singolo eccesso di glutammato a breve termine è sufficiente per indurre una cascata di eventi che coprono scale diverse dal livello della molecola al livello della rete, i quali contribuiscono congiuntamente allo sviluppo delle crisi.

Arnica montana Istituzione della coltura cellulare e valutazione delle sue bioattività citotossiche, antibatteriche, α -amilasi e antiossidanti in vitro

Arnica montana la coltura in sospensione cellulare potrebbe essere una fonte sostenibile di un materiale vegetale produttore di metaboliti secondari (SM) con effetti biologici. Diverse concentrazioni di regolatori di crescita delle piante (0-5 mg / L) sono state testate nelle spiegazioni fogliari per indurre un callo che è stato utilizzato per stabilire una coltura in sospensione cellulare. La cinetica di crescita è stata condotta per 30 giorni. Un estratto metanolico ottenuto dalla biomassa raccolta a 30 giorni di cinetica di crescita è stato frazionato e tre frazioni sono state testate per la bioattività.

Abbiamo indotto un callo con 1 mg / L di picloram e 0,5 mg / L di chinetina negli espianti fogliari, che ha permesso l’istituzione di una coltura in sospensione cellulare, e quest’ultima aveva il più alto contenuto totale di SM al giorno 30. Tre frazioni hanno mostrato differenze nel contenuto totale di SMs, con i valori più alti per grammo come segue: 270 mg di acido gallico equivalente per il contenuto fenolico totale, 200 mg di quercetina equivalente per il contenuto totale di flavonoidi, 83 mg di verbascoside equivalente per il contenuto di acido fenolico totale e 396 mg di partenolide equivalente per contenuto totale sesquiterpene lattone. Le migliori bioattività erano 2-6/g/ml per il 50% di inibizione del radicale 2,2-difenil-1-picrylhydrazil, 30% di vitalità cellulare delle cellule di linfoma a 40 µg/ml, 17% di inibizione contro Escherichia coli Staphylococcus aureus a 8 ug / disk, e α inibizione amilasi al 12% con 10 / g / mL. Il contenuto totale di SM è stato correlato con le bioattività.

Valutazione del potenziale di differenziazione ematopoietica delle cellule staminali pluripotenti umane in sistemi di coltura 2D e 3D

Contesto: I metodi in vitro per la differenziazione ematopoietica delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono una questione prioritaria per la ricerca approfondita sui meccanismi dell’embriogenesi precoce. Finora, i risultati pubblicati sulla generazione di cellule ematopoietiche provengono da studi che utilizzano formati di coltura 2D o 3D, quindi è difficile discernere il loro particolare contributo allo sviluppo del concetto di un modello in vitro unico in stretta somiglianza con in emopoiesi in vivo.
Scopo dello studio: valutare utilizzando le stesse condizioni di coltura e lo stesso andamento temporale, il potenziale di ciascuno di questi due formati per supportare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane in primitive emopoiesi senza attivazione esogena della segnalazione Wnt.
Metodi: Abbiamo usato in parallelo formati 2D e 3D, lo stesso ambiente di coltura e metodi di ana
lisi (citometria a flusso, IF, qPCR) per studiare le fasi di impegno e specificazione del mesoderma, e cellule endoteliali emogeniche alle cellule ematopoietiche CD34 e valutato la loro capacità clonogenica in un sistema CFU.
Risultati: Mostriamo un’adeguata formazione del mesoderma, un impegno efficiente per l’endotelio emogenico, un numero maggiore di cellule ematopoietiche CD34 e potenziale potenziale di formazione di colonie solo nel formato 3D -differenziazione supportata.
Conclusioni: Questo studio mostra che il formato 3D, ma non il 2D, garantisce l’induzione e la realizzazione mediante meccanismi endogeni del programma di differenziazione intrinseco delle cellule staminali pluripotenti umane alle cellule ematopoietiche primitive. Proponiamo che il formato 3D fornisca un livello adeguato di sovraregolazione del segnale endogeno di Wnt / -catenina.

 

Isolamento, coltura e caratterizzazione completa delle proprietà biologiche delle cellule staminali umane derivate dall’urina

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) rappresentano una fonte interessante nel campo dell’ingegneria dei tessuti. Tuttavia, la loro raccolta spesso richiede procedure mediche invasive. Le cellule staminali derivate dall’urina (UDSC) mostrano proprietà simili alle MSC e la loro ottenimento e ulteriore elaborazione non è invasiva per i donatori oltre che a basso costo.

Qui, offriamo un’analisi completa delle loro proprietà biologiche. L’obiettivo di questo studio era di analizzare la loro morfologia, staminalità, potenziale di differenziazione e profilo delle citochine. Abbiamo isolato con successo UDSC da 25 campioni di urina. Le prime colonie sono emerse fino a 9 giorni dopo la semina iniziale. Il tempo di raddoppio cellulare era di 45 ± 0,24 SD e, quando seminate alla densità di 100 cellule / cm , formavano colonie di 42 ± 6,5 SD entro 10 giorni. Le analisi morfologiche hanno rivelato la presenza di due diversi tipi di popolazioni cellulari.

Il primo tipo aveva una forma a chicco di riso e il secondo era caratterizzato da una forma poliedrica. In diverse colture cellulari sono state osservate anche cellule a forma di cupola. Tutti gli UDSC esaminati hanno espresso i tipici marcatori di superficie simili a MSC, CD73, CD90 e CD105. Inoltre, sono stati raccolti terreni condizionati da UDSC e il profilo delle citochine è stato valutato mostrando un tasso di secrezione significativamente più alto di IL-8, IL-6 e chemochine MCP-1 e GM-CSF.

Abbiamo anche indotto con successo UDSC umane in linee cellulari condrogeniche, osteogeniche e miogeniche. I nostri risultati indicano che gli UDSC potrebbero avere un immenso potenziale nella rigenerazione dei tessuti danneggiati.

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