Luglio 4, 2022

Un sistema di coltura cellulare transcomplementazione basato su nucleocapside di SARS-CoV-2 per ricapitolare il ciclo di vita virale completo

La pandemia di COVID-19 in corso è causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Poiché questo virus è classificato come agente di livello 3 di biosicurezza (BSL-3), lo sviluppo di contromisure e metodi di ricerca di base è logisticamente difficile. Recentemente, utilizzando la genetica inversa, abbiamo sviluppato un sistema di coltura cellulare BSL-2 per la produzione di particelle virali simili a componenti di trascrizione e replicazione (trVLP) mediante transcomplementazione genetica.

Il sistema è composto da due parti: RNA genomico SARS-CoV-2 GFP/genN, in cui il gene nucleocapside (N), un gene critico per il confezionamento dei virioni, è sostituito da un gene reporter GFP; e una linea cellulare di confezionamento per l’espressione ectopica di N (Caco-2-N). Il ciclo di vita virale completo può essere ricapitolato e limitato alle cellule Caco-2-N, con la positività GFP che funge da lettura surrogata per l’infezione virale.

Inoltre, abbiamo utilizzato una tecnica di splicing proteico mediata dall’inteina per dividere il gene N in due vettori indipendenti e abbiamo generato le cellule Caco-2-N inteina come linea cellulare di confezionamento per migliorare ulteriormente la sicurezza di questo modello di coltura cellulare. Nel complesso, questo sistema fornisce un metodo sicuro e conveniente per produrre trVLP nei laboratori BSL-2.

Questi trVLP possono essere modificati per incorporare le mutazioni desiderate, consentendo lo screening ad alto rendimento dei composti antivirali e la valutazione degli anticorpi neutralizzanti. Questo protocollo descrive i dettagli del modello di coltura cellulare trVLP per rendere la ricerca SARS-CoV-2 più facilmente accessibile.

LEDitSHAKE: un sistema di illuminazione per ottimizzare il contenuto di metaboliti secondari delle colture in sospensione di cellule vegetali

I metaboliti secondari delle piante sono ampiamente utilizzati nell’industria alimentare, cosmetica e farmaceutica. Possono essere estratti da colture in sospensione di cellule vegetali coltivate sterili, ma la resa e la qualità dipendono fortemente dall’ambiente di coltivazione, inclusa l’illuminazione ottimale. Gli attuali incubatori ad agitazione non consentono di testare in parallelo lunghezze d’onda, intensità e fotoperiodi di luce differenti.

Abbiamo quindi sviluppato LEDitSHAKE, un sistema per l’illuminazione personalizzata multiplex all’interno di un singolo incubatore agitatore. Abbiamo utilizzato la stampa 3D per integrare gruppi di diodi emettitori di luce negli alloggiamenti dei flaconi, consentendo di testare contemporaneamente 12 diverse condizioni di illuminazione (spettro, intensità e fotoperiodo).

Abbiamo fatto una prova di principio di LEDitSHAKE utilizzando il sistema per ottimizzare la produzione di antociani nelle colture in sospensione di cellule di vite. L’effetto di 24 diverse composizioni luminose sul contenuto totale di antociani delle colture in sospensione di cellule di vite è stato determinato utilizzando un approccio alla progettazione di esperimenti.

Abbiamo previsto le condizioni di illuminazione ottimali per la sovraregolazione e la sottoregolazione di 30 antociani e abbiamo scoperto che la luce a lunghezza d’onda corta (blu, UV) massimizzava la concentrazione della maggior parte degli antociani, mentre la luce a lunghezza d’onda lunga (rossa) aveva l’effetto opposto. Pertanto i nostri risultati dimostrano la prova di principio che il sistema LEDitSHAKE è adatto per l’ottimizzazione dei processi basati su colture in sospensione di cellule vegetali.

I profili degli elementi trasponibili rivelano l’identità della linea cellulare e la perdita di eterozigosi nella coltura cellulare di Drosophila

I sistemi di coltura cellulare consentono approfondimenti chiave sui meccanismi biologici, ma soffrono di esiti irriproducibili in parte a causa della contaminazione incrociata o dell’etichettatura errata delle linee cellulari. L’errata identificazione della linea cellulare può essere mitigata dall’uso di protocolli di genotipizzazione, che sono stati sviluppati per le linee cellulari umane ma mancano per molte importanti specie modello.

Qui, sfruttiamo l’osservazione classica che gli elementi trasponibili (TE) proliferano nelle cellule di Drosophila coltivate per dimostrare che i profili di inserimento di TE a livello di genoma possono rivelare l’identità e la provenienza delle linee cellulari di Drosophila. Identifichiamo più casi in cui i profili TE chiariscono l’origine delle linee cellulari di Drosophila (Sg4, mbn2 e OSS_E) rispetto ai rapporti pubblicati e forniscono anche prove che gli inserimenti da solo un sottoinsieme di famiglie di retrotrasposoni ripetuti a lungo termine sono necessari per contrassegnare le cellule di Drosophila identità di linea.

Sviluppiamo anche un nuovo approccio bioinformatica per rilevare gli inserimenti di TE e stimare le frequenze alleliche intra-campione nei dati di sequenziamento dell’intero genoma legacy (chiamati ngs_te_mapper2), che hanno rivelato la perdita di eterozigosi come meccanismo che modella i profili TE unici che identificano le linee cellulari di Drosophila.

Il nostro lavoro contribuisce alla comprensione generale delle forze che incidono sui genomi dei metazoi mentre si evolvono nella coltura cellulare e apre la strada a protocolli ad alto rendimento che utilizzano inserimenti TE per autenticare le linee cellulari in Drosophila e altri organismi.

Coltura di perfusione di cellule ovariche di criceto cinese per applicazioni di bioprocessing

Gran parte del successo dell’industria biofarmaceutica negli ultimi 30 anni si è basato su prodotti derivati da linee cellulari di ovaio di criceto cinese (CHO). Durante questo periodo, i miglioramenti nelle colture cellulari di mammifero sono derivati dallo sviluppo di linee cellulari e dall’ottimizzazione dei processi adatti a processi fed-batch su larga scala.
Originariamente sviluppati per densità cellulari elevate e prodotti sensibili, i processi di perfusione hanno una lunga storia. Spinta da titoli volumetrici elevati e da un ingombro ridotto, la ricerca sui bioprocessi basata sulla perfusione ha riguadagnato l’interesse del mondo accademico e dell’industria. La recente pandemia ha ulteriormente evidenziato la necessità di opzioni di bioproduzione così intensificate. In questa recensione, delineiamo la storia tecnica della ricerca in questo campo in quanto si applica alla produzione di prodotti biologici nelle cellule CHO.
Dimostriamo una serie di tendenze emergenti nella letteratura e le confermiamo con i driver sottostanti nello spazio commerciale. Da queste tendenze, ipotizziamo che il futuro dei bioprocessi di perfusione sia luminoso e che i campi dell’ottimizzazione dei media, dell’elaborazione continua e dell’ingegneria delle linee cellulari abbiano il maggior potenziale. Allineandosi nella sua configurazione continua con le richieste di Industria 4.0, la bioproduzione di perfusione sarà probabilmente un argomento caldo negli anni a venire.
Parole chiave: Cellule ovariche di criceto cinese; Industria 4.0; perfusione; prodotti biofarmaceutici; biotrattamento; bioreattore; sviluppo della linea cellulare; Ingegneria genetica; ottimizzazione dei processi.

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